粤东养殖区分离的2株海洋弧菌及其胞外产物对皱纹盘鲍致死毒性的初步分析

2011年秋,福建和广东地区养殖的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)相继暴发死亡。同年12月,我们从广东汕头病区取样分离得到2株弧菌,其中bb3为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus), bb4为哈氏弧菌(V. harveyi)。本研究以bb3、bb4作为供试菌株对1龄皱纹盘鲍进行侵染实验,获得如下结果：20℃条件下,供试菌及其胞外产物粗提液注射处理均可致受试鲍死亡,浓度2.5×107 cfu/mL 的 bb3与2.0×107cfu/mL的bb4悬液注射可分别引发43.33%和78.02%的受试鲍死亡;供试菌株的致死毒性与注射弧菌的总量正相关,与受试幼鲍的壳长、全湿重负相关;注射或浸泡-创伤两种处理方式均可导致受试鲍死亡,并且因注射供试弧菌而死亡的幼鲍软体部组织被健康鲍取食后也可引发取食者死亡;从侵染实验死亡的受试鲍软体部组织中可重新分离得到这2种供试弧菌。上述结果表明,溶藻弧菌 bb3和哈氏弧菌bb4是皱纹盘鲍的病原菌。药敏试验表明, bb3、bb4均已对抗生素具有一定程度的耐药性,在测试的20种抗生素中,仅有头孢曲松和丁胺卡那霉素是这2株弧菌同时高度敏感的抗生素,但bb3和bb4却对8种抗生素同时表现出抗性。     

九孔鲍养殖中的脓疱病病因分析和药物敏感性研究

在福建沿海养殖的九孔鲍不论是成鲍还是幼鲍均经常发生脓疱病,死亡率可达 50％-60％,其症状与皱纹盘鲍脓疱病相似,但对药物的敏感性却不同．研究发现: 导致福建省的九孔鲍发生脓疱病的主要致病菌为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)而非 河流弧菌(V．fluvialis)．其对多数药物不敏感,在43种抗菌药物中只对呋喃妥因、氯霉 素、痢特灵等中度敏感,而对青霉素、复方新诺明和头孢类药物则完全不敏感．由于上述 药物已被列为禁用渔药而不宜使用,故生产中应以新研制的无公害防治药物替代．     

杂色鲍Haliotis diversicolor溃疡症病原菌的研究

从患病杂色鲍Haliotisdiversicolor病灶上以TCBS及 2 2 1 6E平板划线各分离到两株致病性细菌 ,经人工感染实验可出现与自然发病相同的症状 ,并从感染鲍分离到同一菌株 ,证明该两株菌为杂色鲍溃疡症的病原菌。这两株菌的特征具明显一致性 :革兰氏阴性 ,短杆状 ,极生单鞭毛。氧化酶和过氧化氢酶阳性 ,淀粉酶、明胶酶阳性及脲酶阴性 ,可还原硝酸盐 ,不能利用柠檬酸 ,不产生吲哚和硫化氢 ,MR阳性、V .P实验阴性 ,发酵葡萄糖产酸不产气 ,O/ 1 2 9敏感 ,0 %和 1 0 %胰胨水中不生长。经鉴定该病原菌为亮弧菌ⅡVib riosplendidus-Ⅱ。还对亮弧菌进行了药敏试验 ,该菌对氨苄青霉素、氯霉素、复方新诺明等药物非常敏感 ,这些药物可作为防治该病的首选药物     

高温胁迫对皱纹盘鲍幼鲍免疫因子的影响

为培育抗逆性强的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino),选取经过选育的皱纹盘鲍进行试验,评价其对高温的耐受性。试验共设置4个温度梯度,其中自然水温组(22℃)A为对照组,其他3组高于最适温度,分别为B组25℃、C组28℃以及D组31℃。研究不同温度组幼鲍体内几种免疫因子(AKP,ACP,SOD,LZM等)的变化情况,最终结果显示所选皱纹盘鲍幼鲍体内SOD,LZM,ACP活性有随温度的升高而升高的变化趋势,而AKP的活性在31℃组有轻微下降。总体结果表明,在试验控制的温度范围内该种鲍可以通过自身免疫因子的变化来抵抗高温带来的伤害。     

杂色鲍Haliotis diversicolor溃疡症病原菌的研究

从患病杂色鲍Haliotis diversicolor病灶上以TCBB及2216E平板划线各分离到两株致病性的细菌,经人工感染实验可出现与自然发病相同的症状,并从感染鲍分离到同一菌株,证明该两株病菌为杂色鲍溃疡症的病原菌,这两株菌的特征具有明显一致性,革兰氏阴性,短杆状,极生单鞭毛,氧化酶和过氧化氢酶阳性,淀粉酶,明胶酶阳性及酶性,可达原硝酸盐,不能利用柠檬酸,不产生吲哚和硫化氢,MR阳性,V,P实验性,发酵葡萄产酸不产气,O／129敏感,0％和10％胰胨水中不生长,经鉴定该病原菌为亮弧菌IIVibrio splendidus-II,还对亮弧菌进行了药敏试验,该菌对氨苄青霉素,氯霉素,复方新诺明等药物非常敏感,这些药物可作为防治该病的首选药物。     

养鲍自污染水净化处理的初步研究

用孔石莼变异株Ulvapertusa、活性炭纤维（ACF）和二氯异氰尿酸钠（NaDDT）对养殖皱纹盘鲍HaliotisdiscushannaiIno产生的自污染水进行净化,并用于饲养幼鲍。结果表明,孔石莼变异株能有效地吸收对幼鲍生长产生影响的水化因子──氨氮、亚硝酸盐,而活性炭纤维对污水中的COD_Mn和细菌的吸附率分别达82％和99．98％,经孔石莼变异株处理后的养鲍污水与未处理的养鲍污水对幼鲍生长影响明显不同。文中同时提出了用活性炭纤维、孔石莼变异株和二氯异氰尿酸钠净化养鲍污水的循环反馈投饵养殖模式。     

九孔鲍肠道及其养殖水体中弧菌抗药性的研究

为更好地防治鲍鱼病害的发生和流行,我们对分离自广东汕尾粤顺鲍鱼养殖场九孔鲍肠道及其养殖水体的弧菌菌株的耐药性进行了研究。对所分离鉴定的菌株进行了16种抗生素药物敏感性试验。结果表明,对绝大多数分离的菌株,四环素、青霉素G、卡那霉素、丁胺卡那霉素和新生霉素都不敏感或无作用,氟哌酸、红霉素、氯霉素以及环丙沙星等则均比较敏感：复方新诺明、链霉素和多粘霉素B对所有所实验的菌株均有作用。     

工厂化养殖杂色鲍致病菌副溶血弧菌的分离鉴定及其生理特性

从广东汕尾地区工厂化养殖的患病和死亡的杂色鲍(Haliotis diversicolor)及养殖海水中分离到3株优势菌,经回归感染试验,证实所分离的细菌为杂色鲍的致病菌。经形态、生理、生化等多项指标鉴定,该菌株为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus),并经ATB微生物自动鉴定系统证实鉴定结果。在中国大陆,由副溶血弧菌使杂色鲍致病并大量死亡的事件,本文属首次报道。     

水温及密度对皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)幼虫运输存活率和变态率的影响

本研究以皱纹盘鲍3日龄幼虫为实验材料,开展不同运输水体温度和幼虫密度对运输后幼虫存活率和变态率影响的研究。实验采用双因子实验设计,设置3个温度梯度(分别13、16和20℃),每一温度梯度下设置4个幼虫运输密度梯度(分别为50、100、150和200个幼虫/ml),共12个实验处理,每个处理均设置3个重复组;同时研究了高密度幼虫运输条件下水体溶氧的变化。实验结果表明温度因子、密度因子以及两者的交互作用均对皱纹盘鲍幼虫的存活率和附着率有极显著影响(P0.001),且多重比较表明在条件为水温为16℃,密度为150幼虫/ml下,是最适宜皱纹盘鲍幼虫的运输。本实验同时揭示12 h运输时间内皱纹盘鲍3日龄幼虫具备能耐受低氧水体环境能力(溶解氧DO2 mg/L)。本研究为皱纹盘鲍异地采苗、人工养殖提供参考,也在皱纹盘鲍幼虫增殖放流等领域具有应用价值。     

饲料中添加浒苔对皱纹盘鲍幼鲍生长、存活及体成分的影响

为探索饲料中添加浒苔对皱纹盘鲍幼鲍生长性能及体成分的影响,向基础饲料中添加0%(对照组)、3%、6%、9%、12%的浒苔粉,配制成5种等氮等能饲料,分别饲喂5组初始平均壳长16.11±0.56 mm、平均体质量0.52±0.06 g的皱纹盘鲍幼鲍,每组设3个重复,每个处理200粒,实验持续60 d。结果显示:饲料中添加3～9%的浒苔,可以促进幼鲍生长及存活,并增大足肌粗蛋白含量;以添加6%浒苔最适,此时幼鲍的存活率、壳长特定生长率、体质量特定生长率、摄食率、饲料转化率、增重率及体质量壳长比分别达到97.3%、0.81%·d~(-1)、2.51%·d~(-1)、4.65%·d~(-1)、50.83%、351.92%、89.8 mg/mm,均显著优于其它实验组(P0.05);粗蛋白含量达到17.21%,也显著高于其它实验组(P0.05);然而,当浒苔添加量达到12%时,则降低了幼鲍生长性能及足肌营养成分含量。实验结果为皱纹盘鲍配合饲料配方研究和浒苔的开发利用提供了科学数据。     

噬菌体防治皱纹盘鲍脓疱病的研究

于１９９３年６月在大连太平洋海珍品养殖公司的１２个采集点分离到河流弧菌的Ⅱ的噬菌体,依据过量噬菌体可以全部裂解其宿主菌河流弧菌Ⅱ的特性,用噬菌体对皱纹盘鲍脓疱病进行了生物防治研究。结果表明,使用一定浓度的噬菌体可以有效地治疗或推迟脓疱病引起的鲍死亡,可将鲍的成活率提高５０％以上。探讨了在噬菌生物防治中遇到的难题及解决办法、噬菌体分离规律等问题。     

南方杂色鲍苗大规模死亡病原菌的分离鉴定及其回归感染试验

自2002年下半年开始,南方杂色鲍苗出现大规模死亡的问题,严重影响到南方鲍鱼产业的发展。从汕尾鲍鱼场发病杂色鲍苗中分离到一批菌株,本研究对16号优势菌株进行了比较深入的工作,回归感染试验证明其为病原菌,API 20E条带分析表明其为溶藻弧菌(Vib-rio alginolyticus),药敏试验揭示其对卡那霉素、氯霉素、氨苄西林、链霉素、四环素有抗药性,但对青霉素、复方新诺明、庆大霉素、多粘霉素敏感。本研究结果为我国南方杂色鲍苗掉板症的防治提供科学依据。     

杂色鲍种苗用试验配合饵料

随着鲍的人工育苗数量的不断增多,以及幼鲍从室内培养池移入海区的养殖阶段,直到成为种苗的规格(壳长1—1.5厘米),其饵料仍然是养殖成败的关键之一。福建南部海区杂色鲍(Haliotis diversicolor Reeve)的种苗培育阶段,正值夏季水温升高,采集天然海藻比较困难,鲍的饵料发生短缺;而且为了进一步弥补和提高鲍的饵料中所含蛋白质等营养成分,以提高幼鲍和种苗鲍存活率,加快生长速度,除积极开发利用天然海藻资源外,必须广开饵料新途径,因而研制种苗鲍用试验配合饵料,适当增加能促     

大黄鱼病原副溶血弧菌拮抗菌的筛选

用点种法从大黄鱼肠道优势菌群中筛选出104株病原性副溶血弧菌的拮抗菌,进一步研究拮抗效果最好的11株拮抗菌的抗菌谱和生长曲线,其中NAC平板上筛选的4株拮抗菌的抗菌范围较广,锰营养琼脂培养基上筛选的3株拮抗菌具有生长优势。用BIOLOG板测定了抗菌谱较广、有一定生长优势3株拮抗菌(R22,Y58和J312)的碳源利用情况,结果表明,3株拮抗菌的碳源谱都比较广,都能利用糖类、有机酸和氨基酸等,而且与鱼类营养的竞争较小。16S rRNA基因同源性分析的结果显示与R22,Y58,J312同源性达99%以上的菌株分别来自弧菌属、芽孢杆菌属和假单胞菌属。进一步对R22,J312和Y58三株拮抗菌进行生化鉴定,结果显示R22为溶藻弧菌,J312为荧光假单胞菌,但Y58的种属未能得到确认。所得到的3株拮抗菌R22,Y58,J312在拮抗病原菌、抗菌谱、生长特性和营养利用等方面都初步满足益生菌的筛选条件,有待进一步检测其安全性和实用效果以便能够成为能实用的益生菌。     

以16S和16S—23S rDNA间区为靶区建立副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) PCR快速检测技术

提要应用BLAST程序和DNAstar软件,比较分析了5株副溶血弧菌和其他细菌的16S—23S rDNA间区序列,选取IGSIA作为扩增靶区,结合相邻的16S rDNA序列,设计合成了一对特异性引物,通过优化扩增条件,建立了快速检测副溶血弧菌的PCR方法,对其特异性和敏感性进行了探讨,并初步进行了应用研究。结果表明,新建的PCR方法能特异性地扩增出大小为306bp和552bp的2条带,分别对应于副溶血弧菌的IGS0和IGSIA,检测灵敏度为5.6×102CFU/ml,半个工作日即可得到准确的结果,能有效检测出在杂色鲍、凡纳滨对虾和各种水质中的副溶血弧菌,适用于海洋水产动物副溶血弧菌病的早期快速诊断、水产品的检疫及水质环境的监测。     

皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)不同群体贝壳形态和相对生长变异研究

皱纹盘鲍是我国重要的渔业资源,其地理群体也是我国重要的鲍种质资源来源。不同地理群体间形态及相对生长的差异对皱纹盘鲍资源管理和种质资源鉴定等提供重要参考。以我国自然海区采集的7个皱纹盘鲍群体作为研究材料,通过测定9个形态测量指标并定义了这些测量指标间的17个比率变量,分析了群体内和群体间贝壳形态和体重相对生长的变异。除个别变量外,协方差分析揭示形态比率变量在群体间存在显著变异;异速生长研究揭示了壳形态特征与皱纹盘鲍群体中异速生长差异之间的高度线性相关性,异速生长程度呈现一定的群体区别。非度量多维尺度分析(NMDS)和马氏距离聚类分析(CLUSTER)将皱纹盘鲍群体分为2个组,线性判别分析(LDA)与NMDS和CLUSTER结果相符,然而LDA未能较好的将各种群样本分类。研究结果初步表明皱纹盘鲍表现出与我国沿海环境和/或生态条件差异相关的表型可塑性,然而这种表型差异也可能受到人工底播苗种的遗传影响。研究结果将对于皱纹盘鲍渔业资源管理如管理单位的界定,以及为今后全面评价皱纹盘鲍不同地理群体的遗传变异等提供参考。     

副溶血弧菌特异性卵黄抗体(AHPND-VpIgY)对凡纳滨对虾幼体被动免疫和育苗成活率的影响

将抗高致病性副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)特异性卵黄抗体(AHPND-VpIgY)应用于育苗生产,通过测定氨氮、亚硝酸盐、细菌总数、弧菌总数、相对保护率和育苗成活率,评价了AHPND-VpIgY在育苗期对凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)幼体的保护效果。结果表明,0.1g/m3和0.2g/m3AHPND-VpIgY组的相对保护率为35.7%和57.2%,两者均显著高于非特异性卵黄抗体组(P0.05);两组的育苗成活率为50.8%和57.2%,比对照组分别提高19.1%和25.6%。各实验组氨氮、亚硝酸盐、细菌总数及弧菌总数与对照组无显著差异,对水质无影响。综上,特异性的AHPND-VpIgY能在不改变水质的前提下,有效提高凡纳滨对虾幼体的存活率、相对保护率和育苗成活率,从而提高凡纳滨对虾苗种产量和质量。     

饲料中添加益生菌对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)非特异免疫基因表达量和抗病力的影响

采用实时荧光定量PCR方法,进行肠道复合益生菌对凡纳滨对虾相关免疫基因表达量的研究。通过感染实验,分析饲料中添加益生菌对凡纳滨对虾病毒感染能力的影响。结果表明,Real-time PCR揭示在投喂期间饲料中添加芽孢杆菌/溶藻弧菌组的对虾血淋巴细胞中的proPO、SOD和LZM的相对表达量均显著高于对照组(P<0.05);感染WSSV后,对芽孢杆菌/溶藻弧菌组凡纳滨对虾血淋巴7个采样时间点的proPO、SOD、LZM的表达进行Real-time PCR分析,检测表明WSSV刺激24h后,对虾血淋巴中的proPO、SOD和LZM的表达呈现显著性上调,且分别在48h、96h、96h达到最大值。累积死亡率结果证实饲料中添加益生菌均可提高其对虾抗WSSV感染的能力,尤其以坚强芽孢杆菌活菌与溶藻弧菌活菌配合使用效果更佳。     

患病与健康杂色鲍苗中弧菌胞外产物的比较分析

本实验室于2004年采样自广东深圳下沙鲍鱼场变白掉板杂色鲍苗以及官湖养殖场健康鲍苗,各分离到16和34株弧菌,并对其胞外产物进行了比较分析。结果表明,官湖场健康鲍苗弧菌与下沙场患病鲍苗弧菌相比,前者20.59%(7株)菌株虽不分泌胞外酶但具溶血活性,余之菌株(64.71%,22株)或分泌酶和/或具溶血活性,但同时兼具蛋白酶、明胶酶、卵磷脂酶、脂肪酶和溶血活性的极少(5.88%,2株);后者则所有菌株均分泌胞外酶和/或具溶血活性,25.00%(4株)菌株能分泌四种酶及具溶血毒性,其余菌株(68.75%,11株)可分泌多种酶和/或具溶血活性。结果揭示,下沙鲍鱼场患病鲍苗弧菌分泌胞外酶和具溶血活性的能力明显强于官湖场健康鲍苗弧菌的,同时认为菌株X99-2和X100-8与下沙鲍苗病害潜在相关。