短蛸(Octopus ocellatus)酪氨酸蛋白激酶Btk基因的克隆及其mRNA在细菌刺激后的表达规律*

本研究从前期构建的短蛸cDNA文库中克隆获得了一个短蛸(Octopus ocellatus)酪氨酸蛋白激酶(OoBtk)基因的cDNA全长,其cDNA全长1191 bp,包括5’非编码区(UTR)259 bp,3’UTR 227 bp,开放阅读框(ORF)705 bp,编码234个氨基酸,预测理论等电点为8.50,分子量为27.7 kD。运用实时荧光定量PCR法分析了OoBtk在健康短蛸不同组织及鳗弧菌、藤黄微球菌刺激后短蛸血细胞中的表达规律,结果表明：OoBtk在健康短蛸肌肉、外套膜、鳃、鳃心、系统心脏、肝胰脏、肾囊、胃、性腺和血细胞等各检测组织中均有表达,其中在肝胰脏的表达量最高;短蛸经鳗弧菌和藤黄微球菌刺激后,OoBtk在血细胞中的表达量呈现出了明显的被诱导表达趋势,在鳗弧菌和藤黄微球菌刺激后6 h后表达即增强,并分别在鳗弧菌刺激后48 h和藤黄微球菌刺激后12 h达到最高。OoBtk参与短蛸对于鳗弧菌和藤黄微球菌刺激的应答过程。     

短蛸(Octopus ocellatus)酪氨酸蛋白激酶基因的克隆及其mRNA在细菌刺激后的表达规律

从前期构建的短蛸(Octopus ocellatus)c DNA文库中克隆获得了一个短蛸酪氨酸蛋白激酶(Oo Btk)基因的c DNA全长,其c DNA全长1191 bp,包括5’非编码区(UTR)259 bp,3’UTR 227 bp,开放阅读框(ORF)705 bp,编码234个氨基酸,预测理论等电点为8.50,分子量为27.7 k Da。运用实时荧光定量PCR法分析了在健康短蛸的不同组织以及鳗弧菌和藤黄微球菌刺激后血细胞中Oo Btk的表达规律,结果表明:Oo Btk在肌肉、外套膜、鳃、鳃心、系统心脏、肝胰脏、肾囊、胃、性腺和血细胞等各检测组织中均有表达,其中在肝胰脏的表达量最高;短蛸经鳗弧菌和藤黄微球菌刺激后,Oo Btk在血细胞中的表达量呈现出了明显的被诱导表达趋势,在鳗弧菌和藤黄微球菌刺激后6 h表达即增强,并分别在鳗弧菌刺激后48 h和藤黄微球菌刺激后12 h达到最高。Oo Btk参与短蛸对于鳗弧菌和藤黄微球菌刺激的应答过程。     

脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)组织蛋白酶D基因的克隆及其表达分析

采用RACE技术获得了总长为1853bp的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)组织蛋白酶D基因全长cDNA序列。该基因5′和3′非编码区分别为120bp和572bp,开放阅读框为1161bp,推测编码386个氨基酸,预测分子量为42.36kDa,理论等电点为7.54,命名为EcCatD基因。同源性和系统进化分析表明,EcCatD基因与斑节对虾、美洲螯龙虾的相似性分别为86%和80%,与斑节对虾和美洲螯龙虾紧密聚为一支。荧光定量RT-PCR结果表明,EcCatD基因在血细胞中的相对表达量最高,其次为肝胰腺。该基因在鳗弧菌和WSSV感染后的脊尾白虾血细胞和肝胰腺中的表达量显著增加,并具有不同的时空表达趋势。结果表明EcCatD基因在脊尾白虾免疫反应中具有重要作用。     

大竹蛏(Solen grandis)翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因的分子克隆和表达特征分析

本研究克隆得到了一个大竹蛏(Solen grandis)翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因(SgTCTP)的cDNA全长,其序列全长为1055bp,5′和3′端的非编码区(UTR)分别为54和461bp,开放阅读框(ORF)540bp,编码179个氨基酸,理论等电点为4.50,预测分子量大小19.96kDa。通过荧光定量PCR法检测了SgTCTP在健康大竹蛏各组织中和病原相关分子模式(PAMPs)刺激后的表达规律,结果表明:SgTCTP在检测组织外套膜、鳃、性腺、血细胞、肌肉和肝胰腺中都有表达,其中在肝胰腺中的表达量最高。脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)和葡聚糖(β-1,3-glucan)刺激都能诱导SgTCTP的表达量上调,SgTCTP的表达量分别在LPS和PGN刺激后6和3h达到最高,为空白对照的3.64和3.36倍;β-1,3-glucan刺激后SgTCTP的表达量上升幅度最大,在12h达到最高,为空白对照的11.76倍。SgTCTP可能作为急性时相蛋白参与大竹蛏的免疫应答。     

大菱鲆免疫球蛋白轻链IgL全长cDNA的分离、鉴定及表达分析

实验采用末端快速扩增(RACE)技术从大菱鲆脾脏cDNA文库中筛选得到了免疫球蛋白轻链IgL的全长cD-NA片段。该序列包含47 bp的5′末端非编码区(5′UTR),738 bp的开放阅读框(ORF)和202 bp 3′UTR,整个开放阅读框编码246个氨基酸。系统发生分析表明大菱鲆IgL基因与五条鰤的IgL基因起源关系最近。RT-PCR分析表明,大菱鲆IgL基因只在正常脾脏、肾脏和头肾组织中表达;IgL在大菱鲆胚胎发育细胞期就已开始表达,在大菱鲆胚胎尾芽期和体节期表达持续增强;在鳗弧菌感染大菱鲆脾脏和头肾早期均检测到IgL基因强烈表达,后期表达逐渐减弱;大菱鲆胚胎细胞(TEC)在用鳗弧菌感染48h后,IgL开始表达。这些结果均表明IgL基因在大菱鲆免疫应答中起着重要作用。     

低盐胁迫对脊尾白虾过氧化氢酶和硒谷胱甘肽过氧化物酶基因表达的影响

过氧化氢酶(CAT)和硒谷胱甘肽过氧化物酶(Se-GPx)在抗氧化防御体系中扮演重要的角色,在清除多余的活性氧自由基(ROS)防止机体氧化损伤方面具有重要的作用.本文利用RACE-PCR方法首次从脊尾白虾肝胰腺组织中克隆获得了CAT cDNA全长序列,该基因全长2649 bp,包括5′非编码区(UTR) 78 bp、开放阅读框(ORF)1554 bp和3′非编码区(UTR) 1017 bp,共编码517个氨基酸,预测分子量为58.46 kDa,理论等电点为6.64,利用PROSITE tools预测CAT基因的功能位点,发现该氨基酸序列包括酶活性中心序列“FDRERIPERVVHAKGAG”,亚铁血红素结合信号序列“RLFSYPDTH”和 3个催化位点残基His⁷¹,Asn¹⁴⁴和Tyr³⁵⁴.同源性分析表明,脊尾白虾CAT氨基酸序列与其他物种的相似性为68%-92%.荧光定量PCR分析结果表明,CAT基因在肝胰腺、血细胞、心脏、肌肉、卵巢、鳃、胃和眼柄均有表达,其中在肝胰腺中表达量最高.低盐胁迫后脊尾白虾鳃和肝胰腺中CAT和GPx基因分别在48 h和6 h达到最大值,且与对照组差异显著(P< 0.05),表明CAT和GPx基因参与了低盐胁迫反应,并表现出一定时间效应关系.综合分析结果指出脊尾白虾CAT基因是CAT家族主要成员之一,可能在低盐环境胁迫过程中具有重要的作用.     

文蛤C型凝集素基因(Mm-Lec1)的克隆与表达分析

文蛤(Meretrix meretrix)是我国重要的滩涂养殖贝类,病害严重影响文蛤增养殖业,研究文蛤的免疫机制有助于解决文蛤的病害问题。C型凝集素(C-type lectin)参与先天免疫,在识别病原相关分子模式和激活体液免疫因子等方面发挥重要作用。本研究检索已构建的文蛤全长cDNA 文库,经过Blast比对得到了文蛤C型凝集素1(Mm-Lec1)基因的全长cDNA序列。Mm-Lec1序列全长586 bp,5'和3'非翻译区(UTR)的长度分别为21 bp和79 bp,开放阅读框长度为486 bp,编码161个氨基酸,分子量为18.65 kD,理论等电点为4.98。预测的氨基酸序列中含有信号肽(Met1-Ser19)、糖识别结构域(CRD)和糖结合位点(QPN)。Mm-Lec1的三级结构是紧凑型,含有β片层结构。同源性分析结果表明,Mm-Lec1与其他物种C型凝集素相似度在20%~32%;邻接法(Neighbor-Joining, NJ)进化树分析结果表明,Mm-Lec1与紫贻贝CTL 6和栉孔扇贝CTL A聚为一支。实时荧光定量分析结果显示,Mm-Lec1在文蛤鳃、肝胰腺、闭壳肌、外套膜、性腺和血细胞中均表达,其中鳃表达量最高,血细胞次之,性腺中表达量最少;在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激实验中,6 h时Mm-Lec1在血细胞中的表达量最低,48 h表达量最高,暗示Mm-Lec1参与文蛤抵御细菌入侵的免疫过程。     

三疣梭子蟹几丁质酶基因(PtCht6)的克隆及其在免疫中的功能分析

几丁质酶(chitinase)在甲壳动物的蜕皮、消化和免疫等很多生物学过程中发挥重要功能,为深入探讨几丁质酶的免疫防御机制,本实验利用RACE技术克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)PtCht6基因。该基因cDNA全长2736bp,开放阅读框(ORF)2103bp,编码700个氨基酸,具有几丁质酶GH18家族典型特征。利用实时荧光定量技术分析PtCht6在三疣梭子蟹不同组织、不同蜕皮阶段、不同病原感染以及低盐胁迫(11)下的表达特征,结果显示:PtCht6在各组织中均有表达且在肝胰腺中的表达量最高;在不同蜕皮时期的肝胰腺中,其表达量由蜕皮后期(A/B)、蜕皮间期(C)、蜕皮前期(D)依次递减(P0.05);人工感染WSSV和副溶血弧菌后.PtCht6的表达量在肝胰腺中分别于12h、72h达到最大值,在血细胞中均于12h达到最大值,且相较于对照组,整体显著上调表达(P0.05);低盐胁迫能够显著抑制该基因的表达,最高抑制73倍(P0.05)。同时发现,低盐环境下感染WSSV后,该基因达到峰值的时间明显延迟(至少延迟12h.P0.05)。该研究结果预示PtCht6作为免疫因子参与三疣梭子蟹的病原防御,且低盐胁迫在一定程度上抑制了该基因的免疫功能。     

红笛鲷(Lutjanus sanguineus)CD4和CD4-2基因克隆与诱导表达

应用RT-PCR和RACE-PCR技术克隆了红笛鲷(Lutjanus sanguineus)CD4和CD4-2基因,并分析了它们在健康鱼不同组织的表达分布及免疫刺激物诱导后的表达变化。CD4基因c DNA序列全长2216bp,包含180bp的5′UTR(untranslated regions)、605bp的3′UTR和1431bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码476个氨基酸;红笛鲷CD4-2基因c DNA序列全长为1520bp,包含62bp的5′UTR、525bp的3′UTR和933bp的ORF,编码310个氨基酸。CD4分子由信号肽、4个免疫球蛋白样结构域(D1—D4)构成的胞外区、跨膜区和胞浆区组成,CD4-2分子由信号肽、2个免疫球蛋白样结构域(D1—D2)构成的胞外区、跨膜区和胞浆区组成。荧光定量PCR(Real Time Quantitative PCR,q PCR)分析显示红笛鲷CD4和CD4-2基因在健康鱼的胸腺中表达量最高,其次是中肾、鳃、皮肤、脾、头肾和肠。红笛鲷头肾淋巴细胞体外经脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和刀豆蛋白A(Concanavalin A,Con A)刺激12h后,CD4和CD4-2表达量显著上调(P0.05)。哈维氏弧菌疫苗免疫24h后鳃、头肾、脾脏和肠的表达量显著上升(P0.05)。研究结果为进一步研究鱼类CD4和CD4-2在抗菌免疫反应中的作用提供了基础资料。     

青虾(Macrobrachium nipponense)Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子基因全长cDNA的克隆及表达

采用RACE技术,首次从青虾精巢中克隆得到KSPI基因全长cDNA。青虾KSPI基因cDNA全长890bp,包括80bp的5′UTR,546bp的3′UTR和编码87个氨基酸残基的264bp开放阅读框。预测蛋白包含1个保守的Kazal型结构域(CⅠX5CⅡX(6)VCⅢX(5)TYXNXCⅣX6CⅤX12CⅥ),结构域中P1活性位点为苏氨酸残基。应用MEGA4.1软件对青虾与已报道的虾类共15种KSPI氨基酸序列进行系统进化分析,结果表明,青虾KSPI与同样来源于精巢的罗氏沼虾KSPI进化关系最近聚为一支,其它虾类来源于肝胰腺和血细胞的KSPI聚为另外两支。采用定量PCR技术分析其组织分布,结果显示,KSPI基因在精巢、心脏和卵巢中有较高表达,其中精巢表达水平极高,并与心脏和卵巢表达差异分别达到显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)水平,其它组织表达较弱。     

麻痹性贝毒在毛蚶体内的转化过程研究

麻痹性贝毒能够在贝类体内累积,威胁海产品消费者健康。在以往调查中,多次在毛蚶(Scapharca subcrenata)体内发现高含量的麻痹性贝毒,但对于毛蚶体内麻痹性贝毒的转化过程及其食品安全风险还缺乏认识。通过室内模拟实验,选择太平洋亚历山大藻(Alexandrium pacificum)和链状裸甲藻(Gymnodinium catenatum)作为产毒藻种,研究了两种有毒藻种所产麻痹性贝毒在毛蚶体内的转化过程。结果表明,毛蚶体内主要出现了三种麻痹性贝毒转化过程,一是R1位羟基的还原反应,二是N-磺酰氨甲酰基类毒素R4位磺酸基团的水解反应,三是含羟基苯甲酸(hydroxybenzoate)基团的链状裸甲藻毒素在R4位的水解反应。毛蚶体内麻痹性贝毒的生物转化过程复杂,对毛蚶毒性的影响具有一定的不确定性,未来仍需要进一步深化毛蚶体内毒素累积、代谢、转化过程的研究,同时加强对毛蚶体内毒素含量的全面监测,防范毛蚶可能导致的麻痹性贝毒中毒风险。     

日本鳗鲡(Anguilla japonica)对日本沼虾(Macrobrachium nipponense)的捕食效应

采用捕食者.猎物间捕食效应研究方法,研究了日本鳗鲡对3种体长规格日本沼虾的捕食效应.结果表明:(1)日本鳗鲡与日本沼虾的主要活动时段均为17:00至翌日5:00,期间日本沼虾的活动量随其体长规格的增大而减少,日本鳗鲡的主要捕食时段为0:00-5:00,其对体长2.4cm左右的日本沼虾有较强的追捕行为;(2)日本鳗鲡对日...     

三种扇贝挥发性风味物质指纹图谱分析

为探究海湾扇贝(Argopecten irradians)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)、虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)三种扇贝闭壳肌的挥发性风味物质差异,采用气相色谱-离子迁移谱(gas chromatography-ion mobility spectroscopy,GC-IMS)技术,对三种扇贝闭壳肌在新鲜(40℃)和加热(100℃)情况下进行挥发性成分分析。结果表明:在新鲜状态下,海湾扇贝(HWSB-F)、栉孔扇贝(ZKSB-F)、虾夷扇贝(XYSB-F)闭壳肌中,共定性出27种挥发性风味物质,其中醛类8种,醇类5种,酮类5种,酯类3种,以及醚类、苯类、酸类、烯类和噻唑等。在加热情况下,海湾扇贝(HWSB-C)、栉孔扇贝(ZKSB-C)、虾夷扇贝(XYSB-C)闭壳肌中共定性出52种挥发性风味物质,其中醛类20种,酯类5种,酮类7种,醇类8种,烯类4种,酸类2种,醚类2种,还包括吡嗪、胺类、苯类、含氧杂环等物质。对三种扇贝闭壳肌新鲜组和加热组指纹图谱进行分析,发现新鲜扇贝原有的挥发性风味物质加热后减少,且产生了新的其他种类的挥发性风味物质。扇贝闭壳肌加热组的挥发性风味物质种类较多,组成比较复杂,新鲜组的扇贝闭壳肌挥发性风味物质种类较少,组成简单。通过主成分分析,可在新鲜状态和加热状态下,有效区分三种扇贝闭壳肌组织。三种扇贝闭壳肌挥发性风味物质指纹图谱的建立,丰富了不同扇贝呈味物质的组成成分研究内容,证明GC-IMS技术可快速鉴别三种去壳扇贝闭壳肌的种类,为不同种扇贝闭壳肌以次充好提供检测依据。     

美国红鱼(Sciaenops ocellatus)、鲈鱼(Lateolabrax maculatus)、斜带髭鲷(Hapalogenys nitens)耐流性试验研究

采用续航游泳时间评测指标作为评测鱼类游泳能力的方法,对一龄美国红鱼、鲈鱼、斜带髭鲷的续航时间,美国红鱼的临界(游泳)速度以及水温对美国红鱼续航时间影响进行了初步研究。结果表明,三种鱼中,美国红鱼耐流能力最强,其次为鲈鱼和斜带髭鲷。美国红鱼、鲈鱼、斜带髭鲷三种鱼的续航时间(或续航能力)与水流流速呈乘幂递减关系。水温对美国红鱼的游泳能力有显著的影响,试验结果表明,本文研究的美国红鱼,在水温20℃、流速84cm/s下的持续续航时间最长,可认为是该规格美国红鱼最适游泳水温范围。     

溶藻弧菌体外刺激泥蚶(Tegillarca granosa)血细胞后早期转录组研究

泥蚶(Tegillarca granosa)是我国传统养殖贝类,细菌性疾病导致的死亡已成为制约泥蚶养殖业发展的重要因素,血细胞是泥蚶免疫防御的执行者,血细胞能直接吞噬异物,能通过包囊作用将异物包裹,血细胞还在炎症反应和伤口修复中发挥作用。采用RNA-seq测序技术研究了溶藻弧菌体外刺激后泥蚶血细胞3h和6h时转录组动态变化,与未受刺激血细胞相比,3h时1790个基因表达发生显著改变,包括1319个上调基因和471个下调基因;6h时3183个基因表达发生显著改变,包括2629个上调基因和554个下调基因。KEGG通路富集分析发现溶藻弧菌刺激后免疫相关多个信号通路或生物学过程发生显著改变,如吞噬体、细胞凋亡、蛋白酶体、内质网加工、局部黏附等。部分免疫相关基因表达丰度3h时变化不显著而6h时发生显著改变,部分免疫相关基因3h和6h时表达丰度均显著改变。研究结果为泥蚶血细胞早期免疫反应提供了新的见解,为泥蚶抗病机理研究提供了理论基础。     

笠贝soxb、mox基因的鉴定及在足原基发育中的表达模式

足是软体动物最重要的器官之一,目前对其发育机制尚不了解。软体动物的足由神经和肌肉两部分构成,研究足部神经和肌肉系统在发育早期的的动态变化,对于了解足的形态建成机制具有重要意义。本文利用电镜研究了笠贝(Lottiagoshimai)足的早期发育过程。克隆了lgo-soxb和lgo-mox基因,整装原位杂交表明这两个基因分别表达在早期笠贝幼虫的神经外胚层和中胚层,可作为足发育过程的分子标记。不同发育阶段幼虫的原位杂交结果表明,神经外胚层和中胚层细胞在足发育的起始阶段尚未重叠,而在后续发育阶段,二者相向运动并重叠在一起。结果提示组成贝类足部的神经和肌肉细胞起源于早期胚胎不同的部位,在发育过程中逐渐互相接近并重叠,至担轮幼虫晚期共同作用形成足原基。本研究展示了足原基的早期形成过程,为深入研究软体动物足的发育机制提供了基础信息。     

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)血卵涡鞭虫病的流行病学分析

为解析拟穴青蟹(Scylla paramamosain)血卵涡鞭虫病的流行病学特征,于2012年4—11月采用跟踪监测和实地调查的方法,结合病原分离鉴定及病蟹的病理学观察,统计分析了浙江省温州地区养殖拟穴青蟹血卵涡鞭虫病的流行情况。结果表明,患病拟穴青蟹的肝胰腺、肌肉、鳃等组织病理显示有大量血卵涡鞭虫侵染,并能用PCR方法快速检出。温州地区养殖拟穴青蟹血卵涡鞭虫病在每年5—11月均有发生,7—9月为集中发病时间,死亡高峰出现于8—9月之间,年份间(2010—2012)与发病率无相关性,而不同月份对病害的发生有极显著影响(P0.01)。不同发育阶段以脱壳期的发病率相对较高,发病蟹的规格主要以50g以下的幼蟹和250g以上的成蟹为主。拟穴青蟹血卵涡鞭虫病的发生与水温(r=0.756)和盐度(r=0.631)变化关系较密切,夏、秋季节受梅雨、台风影响而引起水温和盐度的剧烈变化可能是暴发血卵涡鞭虫病的诱发因素。     

hedgehog基因在笠贝(Lottia goshimai)早期发育中的表达模式研究

Hedgehog信号通路参与动物神经系统发育、分节等诸多发育过程,研究该信号通路对理解动物的发育与演化机制有重要意义。对软体动物而言,目前Hedgehog信号通路的研究较少。本文克隆了腹足纲软体动物笠贝的hedgehog基因,利用整装原位杂交技术研究了其在胚胎发育过程中的时空表达规律;并与重要发育基因brachyury及soxb的表达模式进行了比较。结果表明,笠贝hedgehog基因与神经外胚层及中/内胚层相关,可能调控了幼虫神经、肌肉及消化道的分化。通过比较原肠胚及担轮幼虫不同阶段的基因表达模式,研究了hedgehog基因相关的组织和细胞随个体发育进程的动态变化。这些结果为理解软体动物形态发生和重要器官的分化机制提供了基础。     

副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）tdh2基因和鳗弧菌（Kanguillarum）ompU基因二联DNA疫苗制备及其对大菱鲆（Scophthalmusmaximus）免疫保护作用

采用基因工程的方法,将副溶血弧菌的热稳定直接溶血素基因tdh2和鳗弧菌外膜蛋白基因ompU进行融合,在大肠杆菌中得到表达,并利用该融合基因构建二联DNA疫苗pEGFP．N1／tdh2-ompU。用DNA疫苗按10和50μg／尾的剂量通过肌肉注射免疫大菱鲆,对大菱鲆抵抗致病性副溶血弧菌和鳗弧菌的免疫效果进行研究。结果表明...     

紫锥菊提取物对大菱鲆(Scophthalmus maximus)的非特异性免疫功能的影响

本文旨在探讨肌肉注射不同浓度的紫锥菊提取物对大菱鲆(Scophthalmus maximus)的非特异性免疫功能的影响,试验选取体重(250±20)g的大菱鲆作为试验动物,分别注射10、20、40mg/m L浓度的紫锥菊提取物,试验共进行28d,每隔7d采集血液测试非特异性免疫指标,第28天用迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)攻毒,连续观察7d,测定其免疫保护率。结果显示肌肉注射紫锥菊提取物对大菱鲆超氧化物歧化酶(SOD)活力和溶菌酶活力(LSZ)的影响极显著(P0.01);对吞噬细胞吞噬率(PP)的影响显著(0.01P0.05),对吞噬细胞呼吸爆发活力的影响极显著(P0.01)。攻毒试验表明,紫锥菊提取物能够降低迟缓爱德华氏菌攻毒后鱼的死亡率,提高其免疫保护率,尤其是40mg/m L组。本试验研究表明,紫锥菊提取物能显著的提高大菱鲆的非特异性免疫功能,且以注射浓度40mg/m L的效果最好。