利用同源重组质粒pUTK转化蓝藻Synechococcus sp.PCC7942及胸腺素α1的表达

采用本实验室构建的丝状蓝藻Calothrixsp.PCC7601基因整合平台系统供体质粒pUTK转化单胞蓝藻Synechococcussp.PCC7942,通过抗性筛选获得了具卡那霉素抗性的转化藻株。经Southern杂交证实 pUTK部分序列已整合到Synechococcussp.7942染色体DNA上 ;红光诱导后通过蛋白质SDS PAGE电泳 ,Westernblot证实 pUTK的胸腺素α1 基因得以有效表达,表达量达到总蛋白的4.8 %。结果表明,基因整合平台系统供体质粒 pUTK不仅可转化丝状蓝藻Calothrixsp.PCC7601,还可转化单胞蓝藻Synechococcussp.PCC7942。     

利用同源重组质粒pUTK转化蓝藻Synechococcus sp.PCC9742及胸腺素α1的表达

采用本实验室构建的丝状蓝藻Wynechococcus sp.PCC7601基因整合平台系统供体系粒pUTK转化单胸藻Syenchococcus sp.PCC7942，通过抗性筛选了具卡那霉素抗性的转化藻株，经Southern杂交证实pHTKUK部分序列已整合到Synechococcus sp.7942染色体DNA上，红光诱导后通过蛋白质SDS－PAGE电泳，Westem blot证实pUTKpUTK的腺素a1基因得以有效表达，表达量达到总蛋白的4．8％，结果表明，基因整合平台系统供全质粒pHT不仅可转化丝状蓝灌Calothrix sp.PCC7601,还可转化单蓝藻Synechococcus sp.PCC7942.     

整合鲈鱼生长激素基因的蓝藻7942

利用载体pAMll46与烟草花叶病毒35S启动子，鲈鱼生长激素基因GH连接，构建携带鲈鱼生长激素基因的整合型表达载体pAMGH，用自然转化方法将pAMGH导入蓝藻7942，筛选到6株抗壮观霉素，氨苄青霉素敏感的藻落，提取抗性藻落的基因组总DNA，用生长激素基因特异引物进行PCR检测，结果证实鲈鱼生长激素基因已经整合进入蓝藻7942的染色体中。     

耐盐基因转化蓝藻Synechococcus sp. PCC 7942研究

将从极端耐盐的假单胞杆菌中克隆得到的3个基因，即转录调控因子基因，NADH脱氢酶Ⅱ基因和磷酸甘油磷酸酯酶基因转入淡水蓝藻Synechococcus sp.PCC 7942中，使受体藻对NaCl的耐受性从低于2．5％显著提高到4．5％，进一步证明了这3个基因确定与生物的耐盐性密切相关。本实验为进一步培育耐盐经济作物奠定了基础。     

建立螺旋藻转基因体系初报

从钝顶螺旋藻单细胞克隆的制备、重组平台的 克隆、同源重组表达质粒的构建、质粒的电激转化和报告基因的表达等方面对螺旋藻转基因 表达系统进行了研究,初步建立起螺旋藻转基因体系。用次氯酸钠溶液处理获得无菌培养系 ;用钠、钙离子混合液处理,获得了可再生的螺旋藻单细胞。用含EDTA的培养基预培养和用 培养基洗涤可分别去除胞外核酸酶活性和抑制胞内核酸酶活性。以氯霉素乙酰转移酶基因替 换大肠杆菌表达质粒pBV220的抗性选择标记,同时插入系列同源重组片段和萤火虫荧光素酶 基因,构建了同源重组表达载体pBVCS01-04L。电激转化螺旋藻S6-4品系单 细胞,获得了具有稳定氯霉素抗性的培养系,并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实了报告基 因的表达。     

聚球藻hox1基因的克隆和序列分析

本实验应用降落PCR方法从聚球藻Synechococcus cedrorum中扩增出717bp的hox1基因全序列,并与从Gen-Bank下载13个蓝藻hox1基因序列比较,用MEGA4.0进行序列同源性分析及蛋白结构特性分析。结果表明,Synecho-coccus cedrorum的hox1基因与聚球藻Synechococcus PCC7942和钝顶节旋藻Arthrospira platensis的hox1基因序列同源性分别为99.9%和99.2%,氨基酸序列同源性分别为99.6%和97.9%。还用邻接法和最大简约法构建了系统树并进行了聚类分析。     

抑制螺旋藻胞内核酸酶活性的研究

螺旋藻细胞内较高的胞内核酸酶活性是外源基因转化螺旋藻的主要障碍。以供体质粒pEUTISI为酶消化底物，通过多种方法处理螺旋藻细胞，然后检测其内核酸酶粗提液对pEUTISI的降解作用，结果表明，2mmol/L以上的EDTA处理16h或无Mg^2 螺旋藻培养基培养72h以上，都可使处于对数生长期的螺旋藻胞内核酸酶活性显降低；低于28℃（如24℃）培养也可降低螺旋藻的胞内核酸酶活性。根据实验结果，建议在螺旋藻转化前72h开始低温、无Mg^2 培养，转化前16h提高培养基中EDTA的浓度至2mmol/L，就能获得胞内核酸酶活性极低的受体藻，有利于外源基因的转化。     

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导培育富含叶黄素的基因工程小球藻(Chlorella vulgaris)的研究

采用基因克隆技术构建双元载体pCAMBIA2301-idi,通过电转转入农杆菌LBA4404中.利用根癌农杆菌介导的转化方法,将pCAMBIA2301-idi质粒的T-DNA区转入小球藻,以G418抗性基因(NPTⅡ)作为筛选标记,筛选出阳性转化子.通过PCR扩增表明idi基因和NPTⅡ基因已经整合到小球藻基因组中.测定转化子的生物量,结果表明大部分转化子的生物量与野生型相似.测定转化子小球藻干粉的叶黄素含量,发现转化子叶黄素含量最高达到0.84mg/g,与野生型相比提高了30.95％.进一步分析藻液中叶黄素的产量,发现转化子的叶黄素产量最高达到1.98mg/L,比野生型提高了36.77％.     

海洋富油微拟球藻Nannochloropsis gaditana CCAP849/5的转化及外源基因整合方式

微拟球藻Nannochloropsis被认为是具有作为生物柴油原料开发潜力的微藻。为了能够实现工业化生产,有效地利用基因工程或遗传操作手段改造微藻,提高产量,建立稳定有效的遗传转移方法十分必要。本研究以微拟球藻本源β-tublin基因启动子和三角褐指藻Phaeodactylum tricornutm fcpA终止子驱动和终止来源于细菌的sh ble抗性选择基因,构建了一个转化载体pHB4857。将pHB4857以电转移的方法转化海洋富油微拟球藻Nannochloropsis gaditana CCAP849/5。结果显示,转化子可以在3μg·mL-1 zeocin的抗性培养基中生长,PCR检测sh ble基因为100%插入率,转化效率为1.25×10-6。DNA印迹杂交结果表明,外源基因是以随机整合的方式一个或多个拷贝插入到宿主核基因组中的,大多数转化子中的外源基因的整合是完整的。转化子在抗性培养基中每10天传一代,连续传代7个月以上,未检测到抗性基因丢失现象,外源抗性基因可以在宿主细胞中稳定存在。     

海洋球石藻(Emiliania huxleyi)通用表达载体的构建与电转化

海洋球石藻Emiliania huxleyi是一种全球广泛分布的真核浮游植物,该种不仅是海洋碳、硫循环和全球气候变化的重要指示物种,而且能够产生丰富的次级代谢生物活性物质,在生物技术领域也具有很好的应用前景。本文通过分析氨苄青霉素、卡那霉素、G418、氯霉素、链霉素、新生霉素及嘌呤霉素等7种常用抗生素对海洋球石藻生长的影响,确定G418可作为该藻阳性转化藻株的抗性筛选试剂,其对应的抗性基因neo则作为该藻表达载体构建中的抗性筛选标记。在此基础上克隆了绿色荧光蛋白基因gfp、抗性标记基因neo及E. huxleyi BOF92内源性岩藻黄素-叶绿素a/c结合蛋白基因的启动子fcp,以pUC18为基础载体,构建了pUC18-fcp-gfp和pUC18-fcp-neo两个重组表达载体,以电转化方法共转化球石藻细胞并结合选择性固体培养基筛选,成功获得了被转化的球石藻细胞。海洋球石藻遗传转化系统的建立为进一步开展该种相关的基础生物学研究及其在生物技术领域的应用奠定了基础。