鳗弧菌膜绑定溶胞壁质转糖酶MltD的表达纯化及生物信息学分析

本研究将新发现的鳗弧菌毒力相关基因mltD(膜绑定溶胞壁质转糖酶基因)克隆于表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并以镍琼脂糖亲和层析柱纯化表达的融合蛋白;经SDS-PAGE分析,纯化的融合蛋白为单一条带,分子量约为70.2 kDa,与理论预测值相符.生物信息学分析表明,鳗弧菌MltD由523个氨基酸组成,与其他弧菌的MltD氨基酸序列有较高的相似性;二级结构以a螺旋和无规则卷曲为主;功能区包括N端的信号肽区域、1个糖基转移酶结构域和C端的3个溶解酶结构域;蛋白的N端具有一段脂蛋白信号肽,信号肽外的其他部分为非细胞质蛋白.鳗弧菌MltD蛋白为亲水性;不稳定系数为27.40,属于稳定性蛋白;整个蛋白分子共有24个可能的抗原决定簇,具有较强的抗原性.推断MltD蛋白为1种外周膜脂蛋白,在弧菌中相对保守,抗原性强,可应用于抗弧菌病疫苗的开发研制.     

创伤弧菌内膜脂蛋白MFP4的克隆、表达及细胞定位研究

创伤弧菌是一种海洋环境中的重要病原菌。细菌脂蛋白是一类细菌重要的具有不同生理功能的膜蛋白,以大肠杆菌为代表的经典革兰氏阴性菌脂蛋白分泌规律遵循“+2规则”。为探究海洋环境中革兰氏阴性菌的细菌脂蛋白分泌机制是否有别于其他环境中的革兰氏阴性菌,本研究克隆并表达了创伤弧菌的MFP4脂蛋白,该脂蛋白N端成熟肽段第二位(+2位)氨基酸为甘氨酸,根据“+2规则”理论上应定位于细胞外膜。实验利用细菌外膜小体分离鉴定法,在表达MFP4重组脂蛋白的创伤弧菌中对其进行细胞定位后发现, MFP4生物合成后定位于细胞内膜。实验进一步构建了MFP4蛋白N端序列与红色荧光蛋白RFP的融合脂蛋白基因MFP4tether-RFP并在创伤弧菌中表达,细胞定位结果发现该重组融合脂蛋白仍然定位于细胞内膜,说明MFP4成熟脂蛋白的N端携带内膜细胞定位的信息。实验同时构建并表达了外膜脂蛋白LptE的N端序列与RFP的融合重组脂蛋白LptEtether-RFP,该蛋白具有与MFP4相同的N端+2位氨基酸(Gly+2),与MFP4 tether-RFP融合脂蛋白仅有(+3—+10位)8个氨基酸序列的差异。实验发现该融合脂蛋白定位于...     

青蛤(Cyclina sinensis)溶菌酶基因在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激下的表达

利用构建的SMART cDNA文库和高通量测序方法,得到了青蛤溶菌酶相关基因的全长,采用荧光定量RT-PCR方法分析了c型溶菌酶基因在鳗弧菌刺激下的表达变化。结果表明,青蛤有c型溶菌酶和i型溶菌酶基因,分别编码155和182个氨基酸,c型溶菌酶信号肽为21个氨基酸并具有典型的LYZ1结构域,i型溶菌酶信号肽为19个氨基酸,其结构域为Destabilase domain结构,用于识别和切断谷氨酰胺-甲酰胺与赖氨酸ε-氨基之间的肽键。荧光定量PCR结果显示,在鳗弧菌刺激后6—24h,青蛤血细胞中c型溶菌酶的表达量出现明显上调的趋势,与对照组有显著性差异(P0.05),说明c型溶菌酶基因在青蛤的免疫应答中起重要的作用。     

脊尾白虾抗菌肽Crustin基因的克隆、表达与功能研究

为研究脊尾白虾(Exopalaemoncarinicauda)抗菌肽Crustin的结构特征和功能,本研究从脊尾白虾中克隆得到一个Crustin的新变体,命名为EcCrustin1。研究结果表明,EcCrustin1基因cDNA序列长度为740 bp,开放阅读框(ORF)长度为477 bp,编码158个氨基酸,EcCrustin1蛋白具有Ⅱ型Crustin的典型特征,包括N端的信号肽,C端WAP结构域,以及二者之间的甘氨酸富集区(GRR)和半胱氨酸富集区(CRR)。EcCrustin1基因主要在脊尾白虾血淋巴中表达,副溶血弧菌刺激后,EcCrustin1在血淋巴中的表达显著上调(P<0.05),说明EcCrustin1在脊尾白虾先天免疫应答中发挥重要作用。此外,通过原核表达获得了该抗菌肽的重组蛋白,为进一步研究其抑菌功能和机理提供了基础。     

大珠母贝外套膜基因PMMG1的克隆、表达及其特征分析

EF-hand结构域在真核生物细胞内钙离子吸收和运输中发挥重要作用,在贝类中可能参与贝壳和珍珠质的形成。根据已报道的贝类中具有EF-hand结构域的碱基序列设计简并引物,从大珠母贝外套膜cDNA文库中筛选得到PMMG1基因(大珠母贝外套膜基因1)。PMMG1基因全长618 bp,开放读码框编码140个氨基酸,N-端的22个氨基酸肽段为信号肽。PMMG1氨基酸序列与合浦珠母贝PFMG1的一致性为56%,预测有两个EF-hand结构域。选取编码PMMG1成熟蛋白的cDNA序列插入pET-32a质粒构建表达载体,通过IPTG诱导,Ni2+-NTA亲和层析柱纯化,成功获得预期大小的融合蛋白。凝胶电泳迁移率的变化证明PMMG1蛋白具有结合Ca2+/Mg2+的活性,组织特异性表达表明PMMG1基因在外套膜的表达量远高于其他组织。大珠母贝外套膜基因PMMG1的克隆与表达研究为进一步研究该蛋白在珍珠质矿化中的作用、探讨珍珠质形成的分子生物学机制奠定了一定基础。     

致病性鳗弧菌W-1外膜蛋白ompU基因克隆及在大肠杆菌中的表达

从致病性鳗弧菌W-1基因组DNA扩增并克隆了1 156bp的特异性片段,含有完整的外膜蛋白ompU基因阅读框,由993个核苷酸组成,编码330个氨基酸残基的蛋白质。与国外已发表的鳗弧菌外膜蛋白基因的序列同源性为100%,与创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、费氏弧菌(Vibrio fischeri)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的序列同源性分别为72%,69%,68%和64%。将该外膜蛋白基因克隆于pBV220表达质粒,在大肠杆菌中得到了表达,SDS-PAGE分析表明表达蛋白分子量约38kDa,Western blot分析发现表达蛋白能与鳗弧菌外膜蛋白抗体很好的反应。     

副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）tdh2基因和鳗弧菌（Kanguillarum）ompU基因二联DNA疫苗制备及其对大菱鲆（Scophthalmusmaximus）免疫保护作用

采用基因工程的方法,将副溶血弧菌的热稳定直接溶血素基因tdh2和鳗弧菌外膜蛋白基因ompU进行融合,在大肠杆菌中得到表达,并利用该融合基因构建二联DNA疫苗pEGFP．N1／tdh2-ompU。用DNA疫苗按10和50μg／尾的剂量通过肌肉注射免疫大菱鲆,对大菱鲆抵抗致病性副溶血弧菌和鳗弧菌的免疫效果进行研究。结果表明...     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)Pthyastatin抗菌肽基因的克隆与表达分析

采用构建三疣梭子蟹血细胞全长cDNA文库的方法克隆了一个新型抗菌肽基因Pthyastatin,并用荧光定量RT-PCR方法,进行Pthyastatin的表达研究。结果表明,Pthyastatin前体由16个氨基酸残基的信号肽和成熟肽两部分组成,其中Pthyastatin成熟肽有两个结构域:N端的富含Pro/Arg结构域和C端的包含6个保守Cys残基与对虾抗菌肽penaeidins同源的结构域,表明Pthyastatin属于对虾抗菌肽penaeidins家族;荧光定量RT-PCR分析结果表明Pthyastatin在血细胞中高水平组成型表达;致病菌副溶血弧菌诱导后Pthyastatin在血细胞中表达先下调、后上调,在诱导后24h表达量又基本恢复到诱导前水平,支持Pthyastatin在血细胞中高水平组成型表达的观点,但致病菌诱导后表达变化机制不明。     

SsC1qDC基因在毛蚶免疫防御中的作用

含C1q结构域蛋白(C1qDCs)在无脊椎动物免疫应答中发挥重要作用,但目前有关毛蚶(Scapharca subcrenata)C1qDCs免疫功能的研究鲜有报道。本研究从毛蚶中鉴定出一个含有典型C1q结构域的基因(命名为SsC1qDC),并分析了其对主要病原感染的响应特征。SsC1qDC的cDNA全长序列为711bp,编码含有N端信号肽和199个氨基酸的蛋白,系统进化分析显示SsC1qDC与双壳贝类的C1qDCs聚在一起。SsC1qDC在毛蚶卵细胞到眼点幼虫时期的表达量随发育阶段显著增加,且该基因在成体毛蚶各组织中均有表达,其中在肝胰腺和闭壳肌中表达水平较高。副溶血弧菌刺激可显著诱导SsC1qDC基因高表达,敲降SsC1qDC基因表达后毛蚶死亡率和血细胞凋亡水平显著升高,且导致毛蚶血细胞总数和吞噬活力显著下降。同时,敲降SsC1qDC基因的表达可显著抑制母源免疫相关基因Vg、LSZ、Dscam、TEP和SsC1qDC-3的表达,而C3、PAF3、SsC1qDC-1和SsC1qDC-2等基因的表达显著上调。本研究结果表明, SsC1qDC在毛蚶抗弧菌响应中发挥重要作用,对贝类免疫学和抗...     

青蛤(Cyclina sinensis)组织蛋白酶L基因的表达与重组蛋白活性分析

利用荧光定量PCR方法检测了青蛤(Cyclina sinensis)在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)胁迫下组织蛋白酶L基因(CsCPL)在各组织的表达差别及其在血淋巴中的时序表达关系。结果表明,CsCPL基因在青蛤血淋巴、肝脏、外套膜、鳃和闭壳肌等组织中普遍表达,其中以血淋巴表达水平最高。在鳗弧菌刺激后3—96h青蛤的血淋巴中CsCPL的表达量均出现明显上调,其中6h达到最大值并且与对照组有极其显著性差异(P0.01),说明该基因在青蛤免疫反应中具有重要作用。文章还对CsCPL基因进行了原核表达,其产物蛋白分子量约35kDa,经纯化及复性后具有明显的抑菌作用。     

长牡蛎nacrein 基因的克隆、结构及进化分析

首次在长牡蛎(Crassostrea gigas)中克隆得到一种新的贝壳基质蛋白nacrein-like protein F3的全长c DNA序列。nacrein-like protein F3基因c DNA全长1499bp,其中编码区长度为1242bp,编码一条含413个氨基酸残基的多肽链。氨基酸序列比对和结构域分析均表明其为合浦珠母贝(Pinctada fucata)nacrein的同源蛋白,含有1个保守的α-碳酸酐酶结构域,但由于重复结构域的插入,α-碳酸酐酶结构域被间隔成2个亚结构域。系统进化分析显示nacrein-like protein F3与贻贝(Mytilus californianus)nacrein-like protein进化关系最近。此外,在软体动物中,双壳纲nacrein-like proteins进化速度相对较快,推测与寒武纪时期剧烈的环境变化有关,如影响贝壳形成的海水化学变化。     

鳜(Siniperca chuatsi)生长激素基因克隆和原核表达

采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从鳜脑垂体总RNA中扩增生长激素(GH)成熟肽基因,将成熟生长激素的cDNA定向克隆到表达载体pET-32a(+),并转入大肠杆菌BL21(DE3)中。结果表明,鳜生长激素(GH)基因含开放阅读框(ORF)615个核苷酸,编码204个氨基酸,蛋白分子量为23kDa,等电点为7.07,其中酸性氨基酸占10.78%,碱性氨基酸占12.74%,疏水氨基酸为占44.12%,极性氨基酸占32.35%。在IPTG终浓度1.0mmol/L、温度37℃和培养时间4h的最佳诱导表达条件下,鳜生长激素基因(GH)在大肠杆菌中获得高效表达,重组菌体裂解物经SDS-PAGE可检测到分子量约为43kDa的鳜生长激素与硫氧还蛋白(Thioredoxni,Trx)融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白58%。Western印迹分析也证实含6×His标签的重组融合蛋白能够很好地与抗6×His单抗发生反应。本研究为下一步鳜生长激素基因(GH)的生物学功能及应用奠定了基础。     

Changes of proteins in the Antarctic ice microalga Chlamydomonas sp.cultured under UV-B radiation stress

1 IntroductionAntarctic ice m icroalga Chlamydomonas sp., akind ofgreen algae in the Antarctic sea ice, playsavery important role in Antarctic ecological environm ents.Antarctic“ozonehole”enhancesthesolarUVradiationarrivingatseaiceandcontinent. M anyphy…     

重组别藻蓝蛋白(rAPC)的纯化与鉴定

报道了重组大肠杆菌表达的别藻蓝蛋白的下游生产工艺研究,并对产物进行了分析鉴定。工程菌株P1先在NBSBioFlo3000型5L自动发酵罐进行高密度发酵,融合蛋白获得了高效表达,且主要在细胞内以可溶形式存在。纯化前先将获得的菌体超声破碎,然后经硫酸铵沉淀、疏水层析和离子交换层析三步纯化,接着对纯化的重组别藻蓝蛋白(rAPC)进行SDS-PAGE、PAGE、Westernblot等电点分析。证明已获得纯度为96.4%的rAPC,其等电点为6.0,并且具有与天然APC相似的抗原性。     

饲料蛋白水平对奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus × O. aureus)生长、免疫功能以及抗病力的影响

采用单因素实验设计方法,进行了饲料蛋白水平对奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus×O.aureus)生长、免疫功能和抗无乳链球菌能力影响的研究。结果表明,饲料蛋白水平对奥尼罗非鱼生长和饲料利用率以及成活率不产生显著影响,蛋白质效率和蛋白质沉积率伴随着蛋白水平的升高显著下降。35%(D35)饲料组奥尼罗非鱼肝脏过氧化氢酶含量显著高于其它饲料组,然而奥尼罗非鱼肝脏溶菌酶、超氧化物歧化酶活性以及丙二醛含量并不受饲料蛋白水平的影响。无乳链球菌攻毒实验结果表明,蛋白水平对奥尼罗非鱼在攻毒后24h和48h后的累积死亡率是不存在显著影响。本实验的结果表明,24.8%(D25)蛋白水平饲料能够满足奥尼罗非鱼正常生长、以及维持机体正常的非特异性免疫功能和抗病力的营养需求。     

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)Akt/PKB 基因在病原刺激下的表达和功能分析

本文在对中国明对虾转录组数据进行生物信息学分析的基础上,克隆获得了其Akt/PKB基因(FcAkt)的开放阅读框(ORF)的cDNA序列,分析了对虾FcAkt基因的结构特征,并利用实时定量RT-PCR技术分析了FcAkt基因在鳗弧菌、溶壁微球菌和白斑综合征病毒(WSSV)注射后的转录表达变化。结果表明,中国明对虾FcAkt基因的ORF全长为1536bp,编码511个氨基酸,预测蛋白分子量为58.9kDa,理论等电点pI为5.60。同源比对显示该基因的氨基酸序列在不同物种之间具有较高的保守性。进化分析发现FcAkt与地蟹、果蝇、埃及伊蚊、家蚕等节肢动物的蛋白激酶B(Akt/PKB)亲缘关系较近。FcAkt的转录表达在不同细菌或WSSV刺激后具有明显的变化,提示对虾FcAkt基因可能在对虾的免疫防御中发挥了重要作用。     

不同虾种间肌肉组织蛋白质的比较

采用薄层等电聚焦凝胶电泳方法对罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii)、绿须虾（Aristeus virilis)、长毛对虾（Penaeus penicillatus)、日本对（P.japonicus)、斑节对虾（P.monodon)和周氏新对虾（Metapenaeus joyneri）的肌肉组织蛋白质进行分离，检测各蛋白质组份及其等电点。根据蛋白质区带的共享度计算共相互间的遗传距离指数，然后用聚类方法处理数据，构建系统树，分析其间的差异程度，最后确定6种虾的亲缘关系。结果表明，每种虾可获得6－11条 蛋白质区带，等电点范围在4－6．95之间。虾类肌肉组织蛋白质组份及其电泳行为，可为虾类在分类学上的定位提供生化依据。     

适用于条斑紫菜的双向电泳样品制备方法

为了建立适于条斑紫菜(Porphyra yezoensis)蛋白质组学分析的的样品提取方法, 作者以条斑紫菜叶状体为材料, 比较了饱和硫酸铵沉淀法、三氯乙酸/丙酮沉淀法和酚提取方法3 种方法对条斑紫菜叶状体总蛋白的提取效果。结果表明, 针对条斑紫菜叶状体细胞中含有大量多糖, 多酚化合物, 色素等干扰物质的特点, 通过酚提取方法能有效去除这些干扰杂质, 得到清晰、稳定、干净的双向电泳图谱和相对较多的蛋白质点数, 为提高其他大型海藻的总可溶性蛋白提取效率提供了重要参考。     

GSTA is a major glutathione S-transferase gene responsible for 4-hydroxynonenal conjugation in largemouth bass liver

We have previously shown that largemouth bass (Micropterus salmoides) has a remarkable ability to conjugate 4-hydroxy-2-nonenal (4HNE), a mutagenic and cytotoxic alpha,beta-unsaturated aldehyde produced during the peroxidation of lipids. In addition, we have isolated a glutathione S-transferase cDNA (bass GSTA) that encodes a recombinant protein which is highly active in 4HNE conjugation and structurally similar to plaice (Pleuronectes platessa) GSTA. In the present study, HPLC-GST subunit analysis revealed the presence of at least two major GST isoforms in bass liver, with one peak constituting 80% of the total bass liver GST protein. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) and electrospray ionization analysis of the major bass GST subunit yielded a molecular weight of 26,396 kDa. Endo-proteinase Lys-C digestion and Edman degradation protein sequencing of this GST peak demonstrated that this protein was encoded by bass GSTA. Analysis of genomic DNA fragments isolated by nested PCR indicated the presence of a GST gene cluster in bass liver that contained GSTA, and was similar to a GST gene cluster characterized by Leaver et al., in plaice. Collectively, our data indicates the presence of a major GST in bass liver involved in the protection against oxidative stress. This GST is part of a gene cluster that may be conserved in certain freshwater and marine fish.