环介导等温扩增联合横向流动试纸条快速检测扁浒苔(Ulva compressa)的研究

本研究将环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)与横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)的可视化检测方法结合,建立了扁浒苔(Ulva compressa)的LAMPLFD快速检测技术。该方法以扁浒苔的内转录间隔区(ITS1-5.8S-ITS2)序列为检测靶标,设计了3对特异性引物(其中,上游内引物由生物素标记)和1条异硫氰酸荧光素标记的探针。结果表明,LAMP最适反应温度为63°C,扩增时间为60 min,从核酸扩增到LFD结果判读需70 min。利用LAMP-LFD可特异性检出扁浒苔,对浒苔、曲浒苔、缘管浒苔和孔石莼等石莼属绿藻以及塔玛亚历山大藻、无纹环沟藻、东海原甲藻、锥状斯克里普藻和赤潮异弯藻等常见微藻的检测结果为阴性。该方法最低可检测到0.1 pg的扁浒苔基因组DNA,是以Uco ITS-F3和Uco ITS-B3为特异性引物的PCR方法的100倍。对实际样品的检测结果表明,LAMP-LFD方法检测扁浒苔与传统的形态学观察的结果一致。因此,该方法可快速、特异地检测出扁浒苔,而且操作简单,仪器设备依赖性低,有潜力成为扁浒苔现场检测的常规技术手段。     

孔石莼(Ulva pertusa)LAMP-LFD快速检测方法的建立

采用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)进行核酸扩增,凭借横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)完成扩增产物检测,建立了可快速检测孔石莼(Ulva pertusa)的LAMP-LFD方法。该方法首先在孔石莼的内转录间隔区序列(internal transcribed spacer,ITS)的8个种内保守区域设计6条特异性引物(上游内引物由生物素标记),进行由生物素标记的LAMP反应;同时,在两条外引物的有效扩增区段内设计1条异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针,生物素标记的LAMP产物与FITC标记的探针特异性杂交后,在LFD上完成结果显示。优化后LAMP的反应条件为63°C反应50min,加上探针杂交与LFD检测共需60min。结果表明,利用该LAMP-LFD方法可特异性地检出孔石莼,对浒苔(Ulva prolifera)等9种常见藻类的检测均呈阴性。利用该方法最低可检测到3.04×10~(–2) pg/μL的孔石莼基因组DNA,是以LAMP外引物进行的常规PCR方法的1000倍。针对一定数量的实际样本的检测结果表明,LAMP-LFD方法与传统的形态学观察的结果一致。因此,本研究建立的孔石莼LAMP-LFD快速检测方法,具有特异性强、灵敏度高、操作简便等优点,有望成为我国东部沿海孔石莼快速检测和定期监测的有效技术手段。     

中肋骨条藻抗体的制备及酶联免疫检测方法的建立

近年来,以抗体为基础的免疫检测方法逐渐应用于浮游藻类的定性和定量检测。本研究通过制备针对中肋骨条藻细胞的多克隆和单克隆抗体,建立了基于双抗体酶联免疫分析定量检测中肋骨条藻的检测方法。利用该方法对单一藻样品、混合藻样品和现场样品中的中肋骨条藻进行检测的结果与镜检结果相一致,可应用于赤潮藻类的监测,最低检出限度为1/mL。该方法的建立对中国近海赤潮暴发的实时监控具有重要意义。     

基于LAMP-LFD技术的有害赤潮藻东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)快检方法

以东海原甲藻的ITS序列(Internal transcribed spacer,ITS)为检测靶标,将生物素标记的环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)扩增产物与经异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针特异性杂交,并结合横向流动试纸条(Lateral flow dipstick,LFD)肉眼直接观察检测结果,建立了有害赤潮藻东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)的快速检测技术。经优化后的最适条件为63°C、30min,较常规PCR扩增缩短约2h。结果表明:LAMPLFD可特异性检出东海原甲藻,对常见赤潮藻检测结果均为阴性;其对东海原甲藻基因组DNA的检测最低限为47pg/μL,是常规PCR技术(以F3/B3为引物)的10倍。LAMP-LFD技术能高效、特异地检出东海原甲藻,仪器设备依赖性低,结果可视化,有望成为赤潮原因种检测监控的常规方法。     

扁浒苔PCR 快速检测方法研究

扁浒苔(Ulva compressa)能够导致绿潮灾害,对其开展快速检测技术研究是预防和控制其危害的重要技术手段。根据石莼属不同种类核糖体基因转录间隔区域(ITS)的序列设计了一对检测扁浒苔的特异性引物,并对其反应条件和体系进行了优化。PCR特异性检测结果表明,供试扁浒苔均扩增出与预期大小相一致的330 bp产物,而对缘管浒苔(Ulva linza)、浒苔(U.prolifera)、曲浒苔(U.flexuosae)、孔石莼(U.pertusa)的检测结果全为阴性。PCR灵敏度试验表明,该PCR体系最低可以检测到10 pg的扁浒苔DNA模板。本快速检测方法为扁浒苔的早期识别与有效治理提供了科学依据,对相关扁浒苔产业和生态学等研究也具有一定参考意义。     

夜光藻配子细胞实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

夜光藻是我国广泛分布的赤潮原因种之一,其有性繁殖在种群增长中的作用尚不明确,定量分析配子细胞是研究夜光藻有性繁殖过程的重要手段。利用实时荧光定量PCR技术,以夜光藻rRNA基因的18S-ITS1为靶区域,建立了定量检测夜光藻配子细胞的方法。以配子细胞基因组DNA和含目的片段的重组质粒分别建立标准工作曲线,二者均呈现良好的线性响应,检出限分别为每反应0.17个细胞和10²个拷贝,满足定量检测应用需求。应用该方法对2015年逐月采集的胶州湾环境样品进行检测,并首次对夜光藻配子细胞的季节变化、水平分布与垂直分布进行了研究。结果表明,调查海域夜光藻配子丰度呈冬末春初、夏季双峰分布,范围为18.12~9.70×10⁵ cells/L;在水深小于10m的湾内近岸站位,配子丰度较低,垂直分布均匀;在湾中心、湾口和湾外的深水站位,配子丰度较高,仅在2~3月、7月和11月出现垂向差异。夜光藻配子细胞对种群增长和存续有潜在的积极意义,其丰度在营养细胞丰度高值期相对较高,在营养细胞丰度极低时仍可普遍检出。丰富了对近岸海域夜光藻配子细胞时空分布的认识,为深入研究夜光藻的种群增长模式、进一步探究其赤潮暴发的内在机理奠定了基础。     

浒苔孢子在不同材料基质上的附着萌发差异性研究

本研究针对黄海绿潮早期发生过程,以浒苔生殖细胞附着生长特征为切入点,以其主要原因藻种浒苔(Ulva prolifera)为材料,对比研究了不同材料附着基质对浒苔孢子附着萌发的影响。发现孢子在2—6h内的附着率达到80%,尤其是在前2h内的附着速率最快,而且在不同材料的基质上都能完成附着萌发,但萌发数量存在显著差异性,孢子在紫菜养殖筏架相关材料(塑料、竹片、尼龙网衣、塑料网衣)上的萌发率显著高于浅滩、礁石和养殖池相关材料(细砂、海泥、石块)。浒苔孢子还可以在藻段上完成附着萌发,而橡胶和鱼粉袋相关材料对浒苔孢子的萌发存在抑制作用。对比浒苔孢子和配子的萌发特性发现两者有异同点,两者在塑料、竹片等筏架相关材料上萌发率均较高,而孢子在藻段以及橡胶浸出液和鱼粉溶液中的萌发数均显著高于配子。本研究发现紫菜养殖筏架更有利于浒苔孢子的附着萌发,这进一步说明苏北浅滩数十万亩的紫菜养殖筏架在绿潮早期形成过程中为浒苔孢子提供了重要的附着基质。本研究结果将为探讨紫菜养殖筏架在绿潮早期发生过程中的重要作用,并为养殖筏架防附着材料的选用提供参考。     

应用实时荧光定量PCR技术研究九龙江口水域米氏凯伦藻的分布

为快速精确监测九龙江口小型有毒赤潮藻的分布,本工作应用实时荧光定量PCR技术检测了2009年春(5月)、夏(8月)、秋(11月)3个季节九龙江口18个站位水样中米氏凯伦藻(Kareniamikimotoi)的密度.这3个季节分别对应九龙江口水域的丰水期、平水期、枯水期.结果表明,在九龙江口水中米氏凯伦藻的检出范围为未检出至2.3×104cells/dm3;其空间分布差异比较大,主要分布在厦门西港海域,其次是在高潮时的海门岛附近海域;海门岛以西水域几乎未监测到该藻的存在,仅5号站位有1个航次检出.米氏凯伦藻密度的季节分布差异也很明显,春、夏季的密度(最高检出值都达到了2.3×104cells/dm3)明显高于秋季的密度(最高检出值仅为5.4×103cells/dm3).本研究结果可为厦门西港以及九龙江口水域赤潮的研究与监测提供参考.同步进行的显微镜镜检技术没有观测到米氏凯伦藻的存在,可见在藻密度较低(低于103cells/dm3)的情况下,实时荧光定量PCR技术较传统镜检技术(检出限一般在103cells/dm3以上)可能更灵敏.该技术特异性好且操作简便,使对大样本的检测具有可行性,为实现沿岸海域赤潮的动态监测和深入研究奠定了基础.     

长松藻ITS序列特征及其系统进化分析

采用PCR扩增的方法获得了第一个松藻目物种长松藻(Codium cylindricum)的ITS序列,长松藻ITS全长515bp,其中ITS1的长度为74bp,5.8S序列长163bp,ITS2的长度为278bp.与已知的绿藻门其它5个目8个属物种的ITS序列的系统发育分析结果表明,绿藻门物种分为三大支,其中团藻目藻类为一支,松藻目和刚毛藻目藻类为一支,石莼目、顶管藻目和丝藻目藻类构成一大支;长松藻与刚毛藻目的刚毛藻属和硬毛藻属物种同为多核藻体,在系统发生上表现出更近的亲缘关系;不同绿藻目海藻的聚类关系表明,其能够准确地反映出其在单核与多核、单细胞与多细胞等生物结构特性方面的差异与水平.     

绿潮爆发后青岛海域石莼属绿藻的多样性分析

绿潮爆发后在青岛沿海潮间带采集了12株石莼属绿藻,形态学结合分子生物学手段对这些绿藻进行多样性鉴定。经过PCR扩增获得了12株藻的核糖体转录间隔区(ITS)序列以及完整的5.8SrDNA序列。经过序列分析发现,不同藻株的ITS区域在序列长度上存在差异;G+C含量也存在差异,但是都处于较高的水平,最高的接近72%。ITS区域多序列比对结果及系统发育分析显示这些藻株存在种的多样性,而且由分子鉴定得出的多样性与形态上呈现的多样性并不完全一致。本研究结果显示在青岛海域绿潮爆发后石莼藻类仍然存在较好的多样性。     

对虾养殖塘浮游植物的动态变化

2006年7月6日~2006年9月5日,对上虞地区南美白对虾养殖塘水体的浮游微藻群落结构进行调查分析。结果表明:养殖塘中共检出常见浮游微藻4门25属30种,其中蓝藻8种,绿藻18种,硅藻3种,裸藻1种。绿藻门藻种类最多,占藻类种类的60.0%,其次是蓝藻门藻占26.7%,硅藻门藻占10.0%,裸藻门藻占3.3%。主要蓝藻有项圈藻(Anabaenopsis sp)、色球藻(Chroococcus sp)、平裂藻(Merismopedia sp)、微囊藻(Microcystis sp)、小席藻(Phorimidium sp)、螺旋藻(Spirulina sp);常见绿藻有小球藻(Chlorella sp)、空星藻(Coelastrumsp)、卵囊藻(Oocys-tis sp)、盘星藻(Pediastrum sp)等;常见硅藻有舟形藻(Navicula sp)、尖针杆藻(Synedra acus)。养殖早期浮游微藻细胞数量为5.8×107/L,香浓多样性指数平均为1.2005。养殖后期浮游微藻细胞数量为2.5×107/L,香浓多样性指数平均为1.4939。浮游藻类多样性指数总体表现为养殖前期低后期高的特征。     

环介导恒温扩增技术快速检测米氏凯伦藻方法的建立环介导恒温扩增技术快速检测米氏凯伦藻方法的建立

利用环介导恒温扩增（LAMP）技术成功检测了米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)基因，并对其反应程序和反应体系进行了优化，建立起一种简单快速的微藻检测技术。利用本实验优化体系对米氏凯伦藻进行了LAMP扩增，得到了理想的扩增产物，同时以其他8种藻类为阴性对照实验，只有米氏凯伦藻为特异性扩增，其他藻类均呈现阴性反应。另外，对扩增终产物进一步进行酶切分析，并与以F3和B3为引物PCR扩增的片段相比较，均与预期结果相吻合。采用2种方法进行阳性反应检测，一是阳性反应管内可见白色焦磷酸镁沉淀，二是LAMP产物与SYBR Green I反应呈现绿色。这种技术简单快速，有望应用到赤潮藻类的现场检测，在赤潮的预测预报中发挥强大作用。     

应用响应曲面法优化萱藻丝状体单室孢子囊发育条件

为优化萱藻丝状体单室孢子囊发育条件,提高孢子囊比例,研究以萱藻丝状体为材料,在单因素试验的基础上,应用响应曲面法对丝状体单室孢子囊的发育条件进行优化。结果显示,诱导萱藻丝状体单室孢子囊发育的最佳条件为:温度17.67°C,光照强度30.32μmol/(m²·s),外加氮浓度37.37 mg/L,外加磷浓度10.63 mg/L。在该条件下诱导培养20 d,丝状体孢子囊比例为48.92%±5.58%,约为对照组的1.41倍。试验结果与理论预测值的相对误差小于5%,模型可靠。为评价优化培养后萱藻丝状体孢子囊的发育情况,对丝状体进行了阴干刺激(17°C,2h),结果显示,优化培养后的丝状体游孢子放散量(3.33×10⁶ ind./g FW)约为对照组(1.67×10⁶ ind./g FW)的1.99倍。研究表明,在萱藻丝状体单室孢子囊诱导过程中,对诱导环境条件进行有目的性的调控,不仅可以提高孢子囊比例,还可以促进孢子囊发育和游孢子放散的同步性。     

泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)病原霍乱弧菌(Vibrio cholerae)PCR 与LAMP检测方法的比较研究

采用分子生物学方法,以霍乱弧菌lolB为靶基因设计特异性引物,进行了霍乱弧菌的PCR和环介导等温核酸扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测技术研究,并对它们的特异性、灵敏性和实际应用进行了比较.结果表明,所建立的PCR检测霍乱弧菌的方法最低检测限为4.0× 103 CFU/ml; LAMP检测方法在65℃下恒温扩增60min,检测限为4.0×101 CFU/ml,反应产物加入荧光染料SYBR Green Ⅰ后反应液呈现明显的绿色;以温和气单胞菌、副溶血弧菌、鳗弧菌及美人鱼弧菌为对照菌株,检测结果均为阴性;霍乱弧菌人工染菌的8种水产品进行PCR及LAMP检测,结果均为阳性,而未染菌组均为阴性;PCR及LAMP检测霍乱弧菌的方法均具有灵敏度较高、特异性强等优点,且LAMP检测霍乱弧菌的方法灵敏度是PCR方法的100倍,更适合于养殖现场检测的推广使用.     

弗尼斯弧菌PCR检测方法的建立及应用

弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)是近年来国内外学者公认的新食源性致病菌,对全球公共卫生和食品安全造成潜在威胁。本研究根据弗尼斯弧菌的toxS基因分别设计了普通PCR引物和实时荧光PCR引物、探针,建立了用于弗尼斯弧菌快速检测的普通PCR方法和实时荧光PCR方法,对这2种方法的特异性和灵敏度进行比较分析。研究表明,建立的普通PCR方法和实时荧光PCR方法特异性良好,检测灵敏度分别为2 400和24CFU/mL,2种方法的检测灵敏度分别是传统培养方法的10和1 000倍,同时对384份水产品和食品样品进行检测,共检出6株阳性菌株。本研究建立的基于弗尼斯弧菌toxs基因的2种PCR方法特异性均为100%,灵敏度分别为2 400和24CFU/mL,完全满足了弗尼斯弧菌的检测标准,可应用于食品样品中弗尼斯弧菌的检测。     

贝藻混养生态系统模拟实验研究

2013年4~6月,在室内采用实验生态学的方法进行了海湾扇贝(Argopecten irradias)和孔石莼(Ulva pertusavar)4种配比模式的混养实验。各实验组扇贝密度均为48只/m3,孔石莼密度分别为55、121、255和338g/m3。每周采样测定水体中营养盐(NH4-N、NO3-N、NO2-N、PO4-P)的含量及养殖生物的生长情况。扇贝与孔石莼的混养实验结果表明,在养殖系统中引入孔石莼可以改善养殖环境,扇贝和孔石莼的适宜混合比例为1︰1(贝肉湿质量:藻类湿质量)能取得较好的生态效应。     

海州湾条斑紫菜养殖对浮游藻类群落结构及遗传多样性的影响

为了研究条斑紫菜(Porphyra yezoensis)养殖对江苏海州湾浮游藻类群落结构及遗传多样性的影响,于江苏省海州湾条斑紫菜养殖及非养殖海区各设置4个采样位点,采集表层海水,提取海水中浮游藻类的总DNA,PCR扩增浮游藻类核酮糖1,5-二磷酸羧化/氧化酶大亚基(rbc L)基因片段,构建了养殖及非养殖海区rbc L片段质粒文库。在文库中随机选择50个阳性克隆并测序。经比对分析,在条斑紫菜非养殖区发现8种海洋微藻,隐鞭藻占总克隆数22%,海链藻和骨条藻分别占6%和2%;养殖海区发现10种微藻,其中异丝藻占总克隆数22%,优势度明显,仅3种微藻为二海区共有(骨条藻、隐鞭藻及小球藻),表明紫菜养殖及非养殖区浮游藻类群落组成差异显著。条斑紫菜非养殖区及养殖区的浮游藻类香农指数均值分别为3.273和3.654,均匀度指数均值分别为1.090和1.040,显示养殖区浮游藻类遗传多样性较丰富,而群落的成熟度与稳定性非养殖区高。研究证实,表层海水浮游藻类群落结构及组成是动态的,条斑紫菜的养殖行为形成浮游藻类群落结构及遗传多样性较大差异性。     

“微观繁殖体”溯源

通过查阅"微观繁殖体"相关文献,对其概念进行溯源追踪并据以总结归纳。笔者认为"微观繁殖体"这个概念不应该作为放散的孢子、配子、合子、不同生长阶段的显微个体及有生长能力的大型海藻碎片的统称,而应只是泛指那些肉眼不可见的只进行营养繁殖的二倍体细胞团、脱落下来的组织块和"色素体"(有色藻段)等碎片,即是一个或者多个二倍体的藻类细胞。并以石莼属绿藻浒苔(Ulva prolifera)为例,简述浒苔微观繁殖体在其生活史中的主要作用,为浒苔"微观繁殖体"的理论研究和实际利用奠定基础。     

水产动物致病性副溶血弧菌双重PCR 检测方法的研究

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是多种水产养殖动物的主要病原菌,尤其是可引起凡纳滨对虾幼虾呈毁灭性死亡。本研究基于gyrB和toxR两种基因序列设计2对特异性引物,建立一种副溶血弧菌快速、准确的双重PCR检测方法,扩增目的片段大小分别为285 bp和368 bp。结果表明在同一PCR反应体系中副溶血弧菌可同时扩增大小分别为285 bp和368 bp的2种基因片段,两种引物对4种其他水产动物病原菌无交叉反应;敏感性检测结果显示,该双重PCR最低能检测8.867 2×103 CFU/mL菌体浓度的副溶血弧菌,对副溶血弧菌模板DNA的检出极限为0.029 3 mg/L;对发病中国对虾糠虾幼体、水产品及虾池养殖用水进行双重PCR检测,呈阳性反应的样品可分离出优势生长的副溶血弧菌。该实验所建立的基于gyrB和toxR两种基因的双重PCR检测方法可用于副溶血弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及分子流行病学的调查研究。     

长江口及邻近海域有毒藻类和赤潮毒素的本底调查

2004年～2005年在长江口及邻近海域曾发生有毒赤潮13起,约占赤潮总数的15%,引发赤潮的有毒赤潮生物包括链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)、红色裸甲藻(Gymnodinium sanguineum)、米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)和环状异甲藻(Heterocapsa circularisquama),其中曾造成严重危害的有米氏凯伦藻和环状异甲藻。通过连续2年的四季本底调查结果表明,该海域存在多种有毒藻类,主要包括产麻痹性贝毒(PSP)的链状亚历山大藻、塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense),产腹泻性贝毒(DSP)的具尾鳍藻(Dinophysis caudata)、倒卵形鳍藻(Dinophysis fortii);产记忆缺失性贝毒(ASP)的尖刺拟菱形藻(Pseudo-Nitzschia pungens)、多列拟菱形藻(Pseudo-Nitzschia multiseries)和多纹拟菱形藻(Pseudo-Nitzschia multistriata);其它有毒有害藻类包括红色裸甲藻、环状异甲藻、米氏凯伦藻等。有毒藻类种类5、6月份较多,产腹泻性贝毒(DSP)和产记忆缺失性贝毒(ASP)的有毒藻类常年均在该海域出现,这些有毒有害藻类多数密度并不高。与有毒藻类监测同步开展了赤潮毒素检测,长江口贝类赤潮毒素检出时段主要集中在5～6和8～9月份,PSP和DSP检出率分别在5%和12%左右,敏感种类为养殖的紫贻贝,未检出记忆缺失性贝毒。针对目前赤潮的危害中由有毒藻类和赤潮毒素造成的危害较大,建议在长江口贝类养殖海域开展的有毒藻类监测计划,以确保贝类水产品食用安全。