凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)造血激素的组织分布及细胞定位分析

造血激素(astakine)是一种具有促进造血组织细胞分化和增殖作用的甲壳动物细胞因子,参与甲壳动物的造血活动,对于只依赖于非特异性免疫的甲壳动物抗感染能力有重要的意义。本实验室前期成功克隆凡纳滨对虾造血激素(LvAST)的基因Lvast。为了进一步了解其功能,本文通过实时荧光定量PCR技术检测了Lvast表达的组织分布,同时还用Dlight标记抗LvAST抗体进行了LvAST在对虾细胞和组织中的免疫荧光定位分析。荧光定量PCR测定结果说明,Lvast主要在肝胰腺、鳃和肌肉中大量表达,而淋巴器官和血淋巴细胞中表达量较低;免疫荧光结果显示,LvAST可同时存在于血淋巴细胞内和血淋巴细胞膜表面,不同的血淋巴细胞表面的LvAST分布呈现出明显差异,可能具有重要的血细胞分类意义。LvAST蛋白在肝胰腺、鳃、肌肉、淋巴器官等组织中均有分布,并且肝胰腺组织中分布较多,淋巴器官组织中分布较少。     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)Runt转录因子的基因克隆及其功能分析

Runt结构域转录因子家族(Runx)在哺乳动物体内存在三种基因型,分别起着造血,骨生成和控制上皮细胞增殖的作用。本文应用反转录和c DNA末端快速扩增(RACE)技术,首次在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)中克隆并测序了一种Runt(lvrunt)基因全长。lvrunt c DNA全长1754bp,含有1个663bp长的开放阅读框,编码221个氨基酸,理论分子量为23.6k Da,具有Runt-family结构域。对凡纳滨对虾鳃、肠、肝胰腺、类淋巴、心脏、肌肉组织和血淋巴lvrunt的转录特征进行分析,结果显示该基因几乎特异性地在血淋巴细胞中表达,而在其他组织中表达较低。肌肉注射重组造血激素蛋白(r AST)或白斑综合征病毒(WSSV)粗提液均可显著提高lvrunt在凡纳滨对虾体内的转录表达。上述结果提示,lvrunt主要在血细胞发挥作用,可能作为造血激素的下游基因起到调节血细胞增殖和分化的作用,并在受到病毒感染后,参与提升血细胞数量或者促进血细胞分化的过程。     

感染溶藻弧菌及白斑综合症病毒后凡纳滨对虾不同组织的Toll样受体基因表达变化研究

为研究不同类型Toll样受体基因在凡纳滨对虾免疫调控机制中的作用,实验首先通过荧光定量PCR方法检测了凡纳滨对虾3种Toll样受体基因在不同组织中的表达情况。结果表明凡纳滨对虾3种Toll样受体基因m RNA在各组织中均有表达。其中,Toll1基因在肌肉,血淋巴,心脏和鳃均有较高表达,心脏表达量最高;Toll2基因在血淋巴,心脏和鳃均有较高表达,其中在鳃表达量最高;Toll3基因在鳃和心脏有较高表达,其中在鳃表达量最高。实验还对人工感染溶藻弧菌及白斑综合症病毒后凡纳滨对虾3种Toll样受体基因在不同免疫组织的表达变化差异进行研究。感染白斑综合症病毒后凡纳滨对虾血淋巴及鳃中3种Toll样受体基因表达量均显著提高,并在各自达到表达峰值后逐渐下降直至恢复到感染前水平。感染溶藻弧菌后凡纳滨对虾血淋巴中3种Toll样受体基因表达量均显著提高;鳃中Toll1及Toll3表达量分别于感染后3h和12h有显著提高,而Toll2表达量无显著提高。由此推测3种Toll样受体基因均可能参与白斑综合症病毒感染所引起的免疫调控;而在溶藻弧菌感染所引起的免疫调控中,除了Toll1,Toll3参与鳃的免疫调控外,Toll2基因还参与血淋巴中的先天性免疫调控。长期感染白斑综合症病毒或溶藻弧菌后,凡纳滨对虾3种Toll样受体基因在血淋巴与鳃中的表达量均显著升高,这可能与虾体在长期感染过程中,需要不断保持较高免疫水平有关。     

斑节对虾 弧菌病的病理学研究

对患有典型弧菌病症状的养殖斑节对虾进行了病理学研究，取病虾血淋巴制作血涂片，并取鳃、肝胰腺、肌肉等组织作组织病理和超微病理观察，同时取肌注感染后的患病对虾测定血淋巴中超氧化物歧化酶（SOD）的活力，结果显示，患病对虾的血细胞数目急剧减少，胞质浓染，透明细胞很难找到，血细胞形态多样，有的伸出伪足或形成异样突起，患病对虾锶、肝胰腺、心脏、肌肉以及胃肠等组织内均出现程度不同的炎症反应，以肝胰腺最为严重，组织中充满大量的浓染血细胞，细胞肿胀，细胞核核质边聚，线粒体肿胀，变性、严重时整个细胞呈溶解状态，此外，在鳃和肝胰腺组织中还发现溶酶体增多的现象，肌注感染2h后，感染对虾的SOD活力即开始显著下降，之后缓慢回升，至48h恢复大部分活力。     

中国明对虾血蓝蛋白的组织器官分布特点

本文对实验室前期研制的抗中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)血蓝蛋白单克隆抗体进行特性分析,并以该单抗为第一抗体,采用石蜡切片、免疫组化方法,研究了血蓝蛋白在中国明对虾鳃、心、胃、中肠、淋巴器官、卵巢和肝胰脏等组织器官中的分布特点.结果表明:血蓝蛋白在鳃丝小叶边缘的微血腔、心肌束间隙、淋巴器官的淋巴腔中以及肝小管中阳性信号较强;在卵巢卵母细胞之间的血窦、胃内壁环肌层结缔组织的血窦和中肠结缔组织血窦中有阳性信号.结论认为,中国明对虾血蓝蛋白阳性信号大多来自血淋巴而非实质组织,且在血淋巴含量多、血流量大的部位含量丰富,在某些血淋巴无法到达的部位(肝小管内壁)也有血蓝蛋白分布,血蓝蛋白含量的这种组织特异性与各组织器官的功能有着密切的联系.     

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)延伸因子EF-2基因全长cDNA克隆及表达

采用RT-PCR和RACE方法克隆了中华绒螯蟹延伸因子EF-2全长cDNA,序列分析表明EF-2全长2752bp,编码846个氨基酸。经BLASTX分析表明,EF-2核苷酸序列与镶边拟蠢蟹EF-2序列的同源性最高,其相似性为88%;所编码的氨基酸序列与甲壳动物EF-2的氨基酸序列相似性都在90%以上。聚类分析显示,中华绒螯蟹EF-2的氨基酸序列与镶边拟蠢蟹EF-2聚为一支,并与其它甲壳动物聚为一体。荧光定量PCR结果显示,EF-2在正常成熟中华绒螯蟹肌肉中表达量最高,精巢、肝胰腺中有少量表达,心脏、卵巢、胃、肠、鳃中有微量表达。检测了不同发育状态的幼蟹、早熟蟹和正常成熟蟹EF-2在肝胰腺、鳃以及肌肉中的相对表达情况;同时也检测了在不同pH处理下幼蟹EF-2在肝胰腺和鳃中随时间变化的相对表达情况,结果显示pH胁迫对幼蟹EF-2表达有一定的诱导效果。     

凡纳滨对虾卵黄蛋白原和血蓝蛋白mRNA在卵巢不同发育时期的半定量和实时荧光定量PCR分析

卵黄蛋白原和血蓝蛋白是凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)卵巢和/或肝胰腺合成的重要蛋白。利用半定量和荧光定量PCR技术分别检测了亲虾卵巢不同发育期卵黄蛋白原和血蓝蛋白mRNA在卵巢和肝胰腺的相对表达量。结果显示,卵黄蛋白原mRNA在卵巢和肝胰腺中均有表达,其相对表达量随着卵巢发育持续增加,在第五期达到最高,在恢复期迅速下降。根据卵巢和肝胰腺质量的综合计算,凡纳滨对虾的卵黄蛋白中,卵巢的贡献率占主导地位,约占80%,而肝胰腺仅为卵巢的四分之一。血蓝蛋白mRNA主要在肝胰腺中表达,随着卵巢的发育,表达量呈增加趋势,至第三期达到高峰,其后稍有下降,但仍然维持在较高水平,在第六期恢复到初始水平。血蓝蛋白是否直接或间接参与了卵黄发生和卵巢发育有待进一步探讨研究。     

凡纳滨对虾碱性磷酸酶和酸性磷酸酶基因的克隆、表达及盐度应答效应

本研究通过c DNA末端快速扩增法(RACE)首次克隆得到凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)基因的c DNA全长序列,其中ALP基因全长序列1 910 bp,编码536个氨基酸;ACP基因全长序列1 544 bp,编码439个氨基酸。盐度调控设3个盐度组:31(对照)、16和3。养殖45 d后,荧光定量PCR测定对虾肝胰腺、肌肉、胃、肠和鳃5个组织中的ALP和ACP基因m RNA的表达情况。RT-PCR显示,ALP基因在5个组织中普遍表达,在肝胰腺中表达量最高(P0.05),肠道中的表达量最低(P0.05);ACP基因在5个组织中也均表达,在肝胰腺和鳃中表达量明显高于其他3个组织(P0.05)。盐度应答实验表明,不同盐度条件下,不同组织中,ALP和ACP基因存在不同的表达模式。在胃和鳃组织中,ALP基因在31盐度组的表达量显著高于其他两组(P0.05);在肝胰腺和肠道中,ALP基因在16盐度下的表达量明显低于其他两组(P0.05);在肌肉中,ALP基因的表达与其他组织均不同,31盐度组表达量最高,而16盐度组最低(P0.05);在肝胰腺中,ACP基因在31盐度组的表达量明显低于其他盐度组(P0.05);在肌肉和鳃两个组织中,ACP基因在31盐度下的表达量明显高于其余两个盐度组(P0.05);在肠道中,ACP基因的表达量在3盐度组明显高于其他两组(P0.05);而在胃中,ACP基因在3个盐度下的表达量没有显著性差异。上述结果为研究低盐条件下凡纳滨对虾的磷酸酶基因的变化机制提供了参考。     

脊尾白虾酚氧化酶原基因克隆及表达分析

利用RACE方法获得了脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)酚氧化酶原(Prophenoloxidase,proPO)基因。该基因cDNA全长3092bp,开放阅读框2013bp,编码671个氨基酸,其预测分子量为74.82kDa。脊尾白虾酚氧化酶原基因推导的氨基酸序列与其他虾类酚氧化酶原氨基酸序列同源性较高(65%—78%),该氨基酸序列具有铜离子结合位点等酚氧化酶原基因所具有的典型特征位点。组织表达分析结果表明,proPO基因在脊尾白虾血细胞中表达量最高,其次是鳃和肝胰腺组织,在肌肉中几乎不表达。利用荧光定量PCR分析了不同盐度胁迫下脊尾白虾血细胞和鳃组织中的表达变化规律,结果发现在不同盐度胁迫后血淋巴proPO表达量显著高于对照组,盐度胁迫初期鳃组织proPO表达量显著高于对照组。本研究结果表明脊尾白虾酚氧化酶原基因参与了盐度胁迫引起的机体应激反应。     

大竹蛏(Solen grandis)铁蛋白基因的克隆及其在转录水平上对微生物多糖的应答

本研究克隆获得了一个大竹蛏(Solen grandis)铁蛋白(SgFer)基因的cDNA全长,其序列全长为848bp,5’和3’端的非编码区分别为111bp和212bp,开放阅读框525bp,推测编码174个氨基酸,预测分子量为20.2kDa,理论等电点为5.20。通过荧光定量PCR法研究了SgFer在健康大竹蛏组织中以及大竹蛏受到微生物多糖刺激后的表达规律,结果表明,SgFer在血细胞、鳃、外套膜、肌肉、性腺和肝胰腺等组织器官中均有表达,在肝胰腺中的表达量最高。SgFer在大竹蛏受到肽聚糖(PGN)和葡聚糖(glucan)刺激后,其mRNA的表达量显著上调,分别在刺激后6h和12h达到最高;而脂多糖(LPS)刺激不能诱导其mRNA表达量上调。SgFer可能参与大竹蛏对微生物多糖的清除反应。     

口虾蛄超氧化物歧化酶同工酶的组织特异性研究

以口虾蛄为材料进行研究，用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，对其肌肉、心脏、腹鳃、肝胰腺及眼球5种组织器官进行超氧化物歧化酶(SOD)同工酶的研究分析。结果表明：不同组织中超氧化物歧化酶(SOD)的同工酶谱带存在差异，具有明显的组织特异性。眼球、腹鳃、肝胰腺和心脏中有2条酶带，肌肉中几乎不表达，心脏中SOD2和肝胰腺中SODl谱带表达最浓，而腹鳃中的酶带表达最弱。     

重金属离子(Cu~(2 )、Pb~(2 )、Hg~(2 )、Cd~(2 ))对日本鳃丝和肝胰脏显微结构的影响

在实验生态条件下研究了重金属离子(Cu2 、Pb2 、Hg2 、Cd2 )对日本鳃丝和肝胰脏显微结构(15d)的影响。观察结果表明:在2 mg/L Cu2 处理组,日本鳃叶不规则增厚,鳃腔相对扩大,其中血细胞明显增多;上皮层出现破坏:角质膜(CU)呈波状拱起,部分上皮细胞脱离角质膜形成大的空泡(VA);上皮细胞排列不规则,并与数目众多的血细胞充挤于血腔;肝胰脏中构成肝管的细胞发生严重崩解,只残留包被在外周的一层结缔组织的被膜。10mg/L Pb2 处理组鳃丝角质膜明显呈波状突起;肝管结构紊乱,开始出现大量空泡(VA)。0.1 mg/L Hg2 暴露下,鳃丝上皮层偶有溶解现象;肝胰脏肝细胞空泡化(VA)现象更为严重,细胞间界限不明显,肝细胞溶解,有些细胞核固缩;被膜中的结缔组织充血,出现血细胞浸润现象。1 mg/L Cd2 暴露下,鳃丝上皮层严重解体,只剩一层角质层,鳃腔相对扩大,部分区域有充血现象;肝胰脏出现细胞质溶解,细胞间界限不明显,血细胞浸润等现象。     

克氏原鳌虾LDH同工酶的组织特异性研究

以克氏原螯虾为材料,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法,分析了肌肉、眼球、肝胰腺和心脏4种组织和器官中乳酸脱氢酶(LDH)同工酶的表达情况.结果发现,眼球中出现Ldh-5和Ldh-6 2条酶带,肌肉中出现Ldh-1、Ldh-2、Ldh-3、Ldh-4、Ldh-5共5条酶带,肝胰腺中只出现Ldh-6 1条酶带,心脏中出现Ldh-3和Ldh-5共2条带.在这些检测到的酶带中,肌肉中Ldh-5活性最强,染色最深.实验结果表明,不同组织中LDH的同工酶的表达存在差异,表现出明显的组织特异性.     

中国对虾组织细胞中的过氧化物酶体

运用电镜细胞化学技术，研究中国对虾(Penaeus chinensis)组织细胞中的过氧化物酶体，透射电镜下观察中国对虾的淋巴器、肝胰腺、触角腺和中肠4种组织。观察显示：过氧化物酶体主要存在于肝胰腺细胞和触角腺的迷路上皮细胞中。在肝胰腺的R-细胞中过氧化物酶体的形成与粗面内质网、脂滴和胞质溶胶有密切关系。肝胰腺中的R-细胞和触角腺的迷路上皮细胞富含过氧化物酶体，提示这两个组织在对虾降解外来有毒物质的过程中发挥着重要的作用。     

Comparison of S, Se, and 210Po accumulation patterns in common squid Todarodes pacificus from the Yellow Sea and East/Japan Sea

Activities of ²¹⁰Po and concentrations of the chalcogen elements S and Se, were measured in muscle, stomach, gill, and hepatopancreas tissues of two groups of the common squid, Todarodes pacificus, from common spawning grounds but different feeding grounds: The Yellow Sea and the East/Japan Sea. All elements displayed lowest concentrations in the muscle tissues, but while S was highest in stomach and gills tissues, Se and ²¹⁰Po were highest in hepatopancreas tissues, probably due to compartmentalization based on their toxicity. Whole body burden calculations based on organ weight contributions confirmed that the majority of the squids total S is contributed by the muscle while the majority of ²¹⁰Po is contributed by the hepatopancreas. Overall, squids from the East/Japan Sea displayed significantly higher ²¹⁰Po activities than those from the Yellow Sea, in line with previous reports on higher activities of dissolved ²¹⁰Po in the water column of the former compared to the latter, which likely affects bioaccumulation by the foodweb. Tissue-based correlation patterns of the three chalcogens with each other and with the toxic heavy metal Cd suggest S- and Se-containing detoxifying mechanisms for ²¹⁰Po and Cd in stomach and gills, but not in the hepatopancreas, which supports previous hypotheses that both ²¹⁰Po and Cd could be bound to S- and Se-depleted compounds in the squid hepatopancreas.     

核酸探针原位杂交检测白斑综合症病毒的组织特异性

从白斑综合症病毒 (whitespotsyndromevirus ,简称WSSV)部分基因组文库中得到核酸探针 ,采用原位杂交检测方法检测对虾甲壳下表皮、胃、后肠、鳃、触角腺的上皮细胞、淋巴器官的基质细胞、肌细胞、心肌细胞及结缔组织细胞 ,原位杂交结果均为阳性。对虾甲壳下表皮的上皮细胞、胃的上皮细胞对病毒较其它部位敏感 ,感染程度高 ;中肠上皮细胞、肝胰腺上皮细胞、淋巴器官内皮细胞未发现感染病毒 ,原位杂交用于WSSV检测 ,比组织切片HE染色更准确、更敏感。在同一组织的同一部位 ,原位杂交所得到的阳性细胞个数比HE多。探针大小不同 ,敏感性也有变化。短的探针 41 3bp敏感性较高 ,长的探针敏感性降低。     

虾夷扇贝Smad基因家族的鉴定及表达分析

Smad基因介导的细胞信号在调节动物发育和细胞干性方面起着至关重要的作用。由于其功能的多样性和重要性,Smad基因家族一直受到广泛的研究。然而,双壳贝类Smad基因家族缺乏系统的鉴定和分析。为了理解双壳贝类Smad基因家族的进化和生物学功能,本文在虾夷扇贝基因组鉴定出4个Smad基因,并对其遗传和表达特征进行了分析。时空表达谱显示,Smad3基因在虾夷扇贝受精卵和2~8细胞时期有较高的表达量,而在胚胎及幼虫阶段该基因表达量迅速降低,推测其在胚胎早期细胞分裂和分化过程中发挥重要作用。Smad6在胚胎发育早期表达量较低,在囊胚期及原肠胚时期表达量显著升高,可能与母源调控向合子型调控过渡的“中期囊胚转换”有关。Smads基因在各组织中也呈现了独特的表达模式,其中Smad3、Smad5和Smad6分别在肌肉、血细胞和鳃中表达量最高。而Smad4在各个组织内均有表达且表达量相似。实验结果暗示了Smad基因在虾夷扇贝中不仅参与协调了早期胚胎的发育,也与组织器官的形成和稳态有关。本研究有助于理解贝类Smad基因的进化及功能,为深入研究该基因家族在贝类中的生物学功能和调控机制奠定基础。     

凡纳滨对虾P23蛋白基因的筛选、表达和生物信息学分析

克隆凡纳滨对虾极端体重个体的组织差异表达基因P23基因并进行生物信息学分析, 为进一步研究该基因的功能以及凡纳滨对虾的分子选育等研究提供信息。以凡纳滨对虾雌虾极端体重个体腹部肌肉为实验材料, 利用抑制消减杂交(SSH)技术构建极大体重雌性个体和极小体重雌性个体腹部肌肉组织正反向消减cDNA文库:正库(以极大体重个体为试验组, 以极小体重个体为驱动组, L-S)和反库(以极小体重个体为试验组, 以极大体重个体为驱动组, S-L)消减cDNA文库, 并采用实时定量技术分析P23基因的组织表达规律, 利用生物信息学对其功能和结构进行预测。以β-actin为看家基因检测两个文库的消减效率分别为210和25, 实时定量技术分析结果表明P23基因在体重的调节中起上调作用。P23基因编码区序列全长495bp, 编码165个氨基酸, GenBank登录号:JF806619。生物信息学分析发现P23蛋白部分序列含有强疏水性, 无跨膜螺旋结构, 两种信号肽预测都显示P23含有信号肽。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)CYP2基因的cDNA克隆及表达分析

通过RT-PCR及Smart?TM Race技术,首次克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)CYP2基因cDNA全长序列。该基因cDNA全长1662bp,编码一个由492个氨基酸组成的多肽,预测理论等电点为6.348,分子量大小为56.68kD。氨基酸序列中含有CYP基因家族所特有的K螺旋保守序列(ExxR)和血红素结合区(FxxGxxxCxG)。经氨基酸序列比对及系统进化树分析发现,与岸蟹(Carcinus maenas)的同源性最高,达到75%。实时荧光定量PCR结果表明,CYP2基因在肝胰腺、鳃、肌肉、血淋巴、心脏和眼柄中均有分布,在肝胰腺中表达量最高。肌肉注射磺胺嘧啶后,三疣梭子蟹高、中、低三剂量组CYP2基因表达较对照组都有上调,并具有时间差异性,低剂量组表达量逐渐降低,趋于对照组,中剂量组和高剂量组表达量先升高后降低,6h后同一时间点,均是高剂量组表达最高,低剂量组最低。表明磺胺嘧啶可诱导三疣梭子蟹CYP2基因,CYP2基因可能参与三疣梭子蟹的药物代谢反应。     

凡纳滨对虾类Ig定性和定位的初步研究

以凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）为研究对象,运用Western—blotting和免疫组织化学等现代免疫学方法,对对虾中的类Ig（immunoglobulin,免疫球蛋白）蛋白进行定性和定位研究。结果发现,虾血清中有两种分子质量约为70ku和62ku的蛋白可与抗人Ig发生特异性的结合。同时,虾血细胞——无颗粒细胞的外膜及虾类淋巴器、肝胰脏、心脏、胃和肠等5种组织器官的石蜡切片与抗人Ig反应呈不同程度的阳性,其中类淋巴器和肝胰脏显色较深。提示,虾体内确实存在能与抗人Ig发生特异性结合的类Ig蛋白,其不仅存在于虾血清中,还存在于无颗粒细胞、类淋巴器和肝胰脏等组织中,为对虾的免疫系统的研究和疾病的防治奠定基础。