虾夷扇贝Smad基因家族的鉴定及表达分析

Smad基因介导的细胞信号在调节动物发育和细胞干性方面起着至关重要的作用。由于其功能的多样性和重要性,Smad基因家族一直受到广泛的研究。然而,双壳贝类Smad基因家族缺乏系统的鉴定和分析。为了理解双壳贝类Smad基因家族的进化和生物学功能,本文在虾夷扇贝基因组鉴定出4个Smad基因,并对其遗传和表达特征进行了分析。时空表达谱显示,Smad3基因在虾夷扇贝受精卵和2~8细胞时期有较高的表达量,而在胚胎及幼虫阶段该基因表达量迅速降低,推测其在胚胎早期细胞分裂和分化过程中发挥重要作用。Smad6在胚胎发育早期表达量较低,在囊胚期及原肠胚时期表达量显著升高,可能与母源调控向合子型调控过渡的“中期囊胚转换”有关。Smads基因在各组织中也呈现了独特的表达模式,其中Smad3、Smad5和Smad6分别在肌肉、血细胞和鳃中表达量最高。而Smad4在各个组织内均有表达且表达量相似。实验结果暗示了Smad基因在虾夷扇贝中不仅参与协调了早期胚胎的发育,也与组织器官的形成和稳态有关。本研究有助于理解贝类Smad基因的进化及功能,为深入研究该基因家族在贝类中的生物学功能和调控机制奠定基础。     

虾夷扇贝TET基因在配子发生和早期发育中的表达模式

DNA甲基化参与调节动物配子发生和胚胎发育过程,TET基因负责DNA主动去甲基化,在基因印迹去除和细胞全能性获得中起重要作用。为了解海洋贝类配子发生和胚胎发育过程中DNA去甲基化如何发生,本研究以虾夷扇贝为研究对象,鉴定了其TET基因,并分析了该基因在性腺和胚胎幼虫发育中的表达变化。结果表明,虾夷扇贝基因组中含有1个TET基因(PyTET),该基因长39127 bp,包含10个外显子,编码1592个氨基酸,其蛋白具有完整的2OGFeDO超家族的加氧酶结构域。在性腺发育过程中,PyTET基因表达峰值出现在休止期精巢和增殖期卵巢,原位杂交结果显示其在精原细胞、精母细胞中均有表达,在卵母细胞中的表达明显高于卵原细胞;在早期发育过程中,其峰值出现在囊胚期。以上结果提示虾夷扇贝配子发生和胚胎发育过程中均发生了DNA主动去甲基化,这将有助于系统了解表观调控在贝类发育中的作用。     

高温下3种壳色虾夷扇贝存活率、代谢率、免疫酶活力及HSP70表达的比较研究

以3种壳色虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)(枫叶贝、红贝、白贝)为实验材料,将在15℃暂养的3种壳色虾夷扇贝分别驯化至20,22,24和26℃4个温度梯度(升温幅度为1℃/d),待各处理组达到对应温度梯度后暂养7 d,测定比较3种壳色虾夷扇贝的存活率、耗氧率和排氨率、抗氧化酶活力和热激蛋白HSP70表达等指标。结果表明:随着温度的升高,3种壳色的虾夷扇贝的存活率呈先上升后下降趋势,其中,白壳色虾夷扇贝的存活率在同一处理组中最高;3种壳色的虾夷扇贝耗氧和排氨率均随温度升高呈现先升高后降低的趋势,同一温度处理组下白壳色虾夷扇贝的代谢率始终高于红贝和枫叶贝;另外,总抗氧化能力(total-antioxidant capacity,T-AOC)、超氧化物歧酶(activity of superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)4种免疫酶的活性随温度升高也呈现先升高后降低的趋势,且同一温度处理组下白壳色虾夷扇贝的免疫酶活力始终高于红贝和枫叶贝;3种壳色虾夷扇贝鳃HSP70的表达模式基本相同,随着温度的逐渐升高,HSP70持续表达,到26℃时表达量最高,且白壳色扇贝HSP70的相对表达量最高为5.07。综上,白壳色虾夷扇贝在高温应激下表现出较强的抵抗和耐受能力,因此,可将其作为后期耐高温型虾夷扇贝新品系的重要培育材料。     

应用MSAP技术研究扇贝全基因组DNA甲基化水平

DNA甲基化作为真核生物基因组重要的表观遗传学修饰,对生物体基因的表达有重要的调控作用。为获得扇贝基因组DNA甲基化修饰水平及模式等表观遗传学信息,以栉孔扇贝(Chlamys farreri)、海湾扇贝(Argopecten irradians)、虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)以及本课题组培育的"海大金贝"为材料,建立了甲基化敏感扩增多态性方法(Methylation-sensitive amplified polymorphism,MSAP)的反应体系,利用该方法对其基因组DNA CCGG区域的甲基化水平进行分析。结果表明,本研究筛选得到的引物组合可用于贝类DNA甲基化的研究,在栉孔扇贝、海湾扇贝、普通虾夷扇贝和"海大金贝"的甲基化比例分别为32.08%、25.99%、32.88%和34.97%。几种扇贝基因组CCGG序列中,胞嘧啶的全甲基化率要高于半甲基化率,推测扇贝基因组中主要的甲基化模式是CpG型。通过对"海大金贝"和普通虾夷扇贝闭壳肌甲基化谱进行比较,筛查得到46个差异位点,这些位点可能参与"海大金贝"闭壳肌积累类胡萝卜素的调控。     

流式细胞术比较研究4种双壳贝类血细胞的分群

应用流式细胞术对太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)、海湾扇贝(Argopecten irradians)、虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)和毛蚶(Scapharca subcrenata)4种双壳贝类的血细胞分类进行了比较。根据其血细胞的前向角散射光(FSC)和侧向角散射光(SSC)特性的不同将血细胞分群,FSC和SSC二维图分析发现太平洋牡蛎、海湾扇贝和虾夷扇贝的血细胞都可分为3个亚群,即透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞,而毛蚶的血细胞只可区分为透明细胞和颗粒细胞2个亚群。同时还对这4种双壳贝类各种血细胞所占比例进行了比较研究,发现各亚群细胞所占比例差异很大。     

控制虾夷扇贝闭壳肌积累类胡萝卜素相关基因的筛查

利用抑制性差减杂交技术(Suppression subtractive hybridization,SSH)对虾夷扇贝闭壳肌积累类胡萝卜素相关基因进行筛查和分析。以虾夷扇贝橘红色闭壳肌和白色闭壳肌cDNA构建正反向差减文库,结合454测序技术在正向差减文库中测序得到2 640条序列,拼接得到50个contigs(重叠群);反向差减文库中测序得到2 496条序列,拼接得到187个contigs。经过同源性比对分析,共获得150多个差异表达基因,从中选择3种清道夫受体SRB1、SRF2和SRCR作为候选基因进行研究,对其在虾夷扇贝各组织中的表达量水平进行检测,初步阐述了其在虾夷扇贝中的组织表达规律。根据结果推测在虾夷扇贝橘红色闭壳肌中,清道夫受体有可能是调节类胡萝卜素累积和转运的关键基因。本研究为虾夷扇贝闭壳肌类胡萝卜素累积相关通路的探索提供了初步研究的基础数据。     

虾夷扇贝养殖技术

虾夷扇贝是海珍品之一,是日本、朝鲜的主要海水养殖品种,为目前世界扇贝科中经济价值最高、产量最大的种类。 虾夷扇贝与栉孔扇贝在生物学上有些不同,它不是终生附着生活, 一般当壳高达7～8mm后便失去足丝。     

6种海洋双壳类贝壳中碳酸钙、碳酸镁含量的测定

为了了解海洋双壳类的固碳能力,以紫脲酸铵-萘酚绿B、铬黑T为指示剂,采用络合滴定法对泥蚶(Tegillarca granosa)、四角蛤蜊(Mactra veneriformis)、文蛤(Meretrix meretrix)、缢蛏(Sinonovacula constricta)、虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)和紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)等6种海产双壳贝类贝壳中的碳酸钙含量、碳酸钙和碳酸镁总量进行了测定。6种贝类贝壳中的碳酸钙含量占干重比例介于93.99%~97.35%之间,其中虾夷扇贝的含量最多,紫贻贝的含量最少;碳酸镁含量介于0.61%~1.79%之间,其中紫贻贝的含量最多,虾夷扇贝的含量最少。目前的结果表明,六种贝类均具有较好的固碳能力,基于碳酸钙和碳酸镁总量估算,6种贝类单位湿重固碳力介于0.023 2~0.074之间。     

栉孔扇贝高多态基因筛查及其表达特征分析

双壳贝类经历了几亿年的进化过程,在复杂多变的海洋环境中展现出了非凡的环境适应能力,而基因组的高多态性被认为与其环境适应性有关。本研究利用栉孔扇贝基因组重测序数据、早期发育及成体转录组数据分析了基因的多态性与表达特征。在栉孔扇贝基因组中共鉴定到了1 186个高多态基因,这些基因在染色体上呈现非均匀分布,并且在胚胎发育时期和成体组织中呈现出独特的表达特征。功能富集分析显示这些多态基因可能为扇贝胚胎发育的可塑性和成体的环境适应性提供了分子基础。研究还发现2个多拷贝基因——mucin和C1qDC具有显著的高多态性,可能在免疫系统防御和清除病原的过程中发挥了重要作用。本研究对高多态基因的表达特征和多态性进行了联合分析,为解析扇贝适应性进化的分子机制提供了线索。     

北黄海海域虾夷扇贝体内脂溶性藻毒素分析

海洋中有毒藻类产生的藻毒素能够经由食物链在滤食性贝类体内累积,危及人类健康。高效液相色谱-串联质谱联用技术(HPLC-MS/MS)可以对多类脂溶性藻毒素进行同步分析,是贝类中脂溶性藻毒素检测的首选方法。本文应用液-质联用方法,对北黄海虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)中的脂溶性毒素进行了分析。虾夷扇贝样品于2011年采自北黄海海域,并解剖为闭壳肌、外套膜、内脏团和性腺四部分。在虾夷扇贝中共检测到大田软海绵酸(Okadaic acid,OA)、鳍藻毒素-1(Dinophysis toxin 1,DTX1)、扇贝毒素-2(Pectenotoxin 2,PTX2)和虾夷扇贝毒素(Yessotoxin,YTX)四种脂溶性毒素成分。在扇贝各组织中,内脏团毒素含量最高(OA:1.97—2.99μg/kg;DTX1:4.97—77.29μg/kg;PTX2:1.12—50.08μg/kg;YTX:825—6680μg/kg),其次是性腺和外套膜,闭壳肌中毒素含量最低。各组织之间的毒素组成情况没有明显差异,均以YTX含量最高,占脂溶性藻毒素总含量的90%以上。除YTX外,扇贝体内还存在一定量的OA、DTX1和PTX2毒素,虾夷扇贝中检出PTX2在我国系首次报道。北黄海海水样品中存在较高密度的渐尖鳍藻(Dinophysis acuminata)和倒卵形鳍藻(D.fortii),可能是虾夷扇贝体内OA,DTX1和PTX2的潜在来源。为防范虾夷扇贝中藻毒素造成危害,应进一步强化对北黄海海域贝类中藻毒素及海水中有毒藻类的监测。     

基于COI和ITS-1基因对魁蚶野生群体和人工繁育子代的遗传分析

采用线粒体 COI 基因和核糖体第一内转录间隔区 ITS-1基因,对荣成(RC)和即墨(JM)2个魁蚶(Scapharca broughtonii Schrenck)野生地理群体及一个人工繁育的即墨子代(JZ)群体,进行遗传多样性和遗传结构分析,探讨即墨人工繁育的子代作为荣成魁蚶底播增殖苗种的可行性。分子方差分析(AMOVA)结果表明,3个群体的遗传差异主要存在群体内。荣成野生群体和即墨野生群体间的Fst值,基于COI基因和ITS-1基因分别为0.1678和0.1193,表明荣成野生群体与即墨野生群体之间存在中等程度的遗传分化。单倍型多样性和核苷酸多样性分析结果表明,人工繁育的即墨子代群体的遗传多样性明显降低。荣成野生群体与即墨子代群体之间的遗传差异,较之与即墨野生群体间的遗传差异更大。如果采用即墨子代在荣成底播,可能会对荣成野生魁蚶野生群体的遗传结构产生一定影响,因此,采用即墨人工繁育子代作为荣成魁蚶底播增殖的苗种来源时必须十分慎重,并在苗种繁育时尽量采用大群体有效亲本。     

水产动物致病性副溶血弧菌双重PCR 检测方法的研究

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是多种水产养殖动物的主要病原菌,尤其是可引起凡纳滨对虾幼虾呈毁灭性死亡。本研究基于gyrB和toxR两种基因序列设计2对特异性引物,建立一种副溶血弧菌快速、准确的双重PCR检测方法,扩增目的片段大小分别为285 bp和368 bp。结果表明在同一PCR反应体系中副溶血弧菌可同时扩增大小分别为285 bp和368 bp的2种基因片段,两种引物对4种其他水产动物病原菌无交叉反应;敏感性检测结果显示,该双重PCR最低能检测8.867 2×103 CFU/mL菌体浓度的副溶血弧菌,对副溶血弧菌模板DNA的检出极限为0.029 3 mg/L;对发病中国对虾糠虾幼体、水产品及虾池养殖用水进行双重PCR检测,呈阳性反应的样品可分离出优势生长的副溶血弧菌。该实验所建立的基于gyrB和toxR两种基因的双重PCR检测方法可用于副溶血弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及分子流行病学的调查研究。     

大黄鱼cGAS-like基因isofrom X1的克隆鉴定及在感染刺激隐核虫后的表达变化

cGAS(cyclic GMP-AMP synthase)基因是近几年来新发现的先天免疫中一个新型的信号分子。作者基于大黄鱼(Larimichthys crocea)基因组信息,用cDNA末端快速扩增(RACE)技术在鳃组织中克隆鉴定了cGAS基因cDNA全长序列:包含1个231 bp的5′端-非翻译区(5′-UTR)、207 bp的3′-UTR和1 488 bp的开放阅读框(ORF),命名为Lc-cGAS-like X1。该基因编码1个由495个氨基酸残基组成的多肽,预测的分子量(Mw)大小为56.57kDa,理论等电点(pI)为9.45;序列分析表明其预测的蛋白无信号肽,第115～431位氨基酸序列为Mab-21功能域,第470～492位氨基酸序列为跨膜结构域。基因组全长3 153 bp,包含8个外显子和7个内含子,所有内含子的剪切特点都符合GT-AG规则。同源比对结果显示:Lc-cGAS-likeX1与鱼类cGAS的相似性大于66%,与高等脊椎动物的相似性较低。系统进化分析表明Lc-cGAS-like X1与鱼类cGAS聚成一支。荧光定量PCR(qPCR)检测显示Lc-cGAS基因(X1/X2两种剪切体)在大黄鱼9种组织中均有表达,其中在鳃中的表达量最高;刺激隐核虫感染后,大黄鱼免疫器官头肾中Lc-cGASmRNA分别在刺激隐核虫幼虫感染阶段和滋养体脱落阶段出现了极显著上调(P0.01);解毒器官肝脏中分别在滋养体脱落阶段和细菌感染阶段出现极显著上调变化(P0.01)。本研究结果暗示大黄鱼cGAS基因参与了大黄鱼感染刺激隐核虫的免疫防御过程,为进一步了解鱼类cGAS基因的多样化功能提供参考。     

矛尾复虾虎鱼溃疡病病原创伤弧菌的鉴定

2009年8月江苏连云港赣榆县多家虾蟹养殖塘混养的矛尾复虾虎鱼（砂nechogobius hasta）大量死亡．从病鱼深层溃烂组织及肝脏中分离出大量优势生长的细菌,人工感染试验证明分离菌对虾虎鱼的半数致死量（LD,0）为1．63×10^6cfu／g。对分离菌进行了形态特征、理化特性和分子生物学等方面的分析。一方面．分离...     

泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)病原温和气单胞菌(Aeromonas sobria)分子鉴定及耐药性研究

采用常规生理生化特性测定及16SrRNA、gyrB及rpoD基因同源性检索与系统发育学分析等分子生物学方法,对引起养殖泥鳅大量死亡的病原细菌进行了综合鉴定。生理生化特性结果表明,分离菌株NQ090701与气单胞菌属的温和气单胞菌相近;16SrRNA、gyrB及rpoD基因Blast序列同源性检索与系统发育学分析均与温和气单胞菌相似性最高;综合形态与生理生化特征及16SrRNA、gyrB与rpoD基因的分子特征,确认分离菌株NQ090701为温和气单胞菌(Aeromonas sobria)。同时,采用试管稀释法测定了养殖生产中常用的10种抗菌药物对病原温和气单胞菌的体外最小杀菌浓度(Minimal Bactericidal Concentration,MBC),结果表明氟哌酸杀菌作用最好,其次为盐酸沙拉沙星;甲砜霉素和复方磺胺甲恶唑在所试验的药物浓度范围对温和气单胞菌无杀菌效果。     

缢蛏天然抗性相关巨噬蛋白2(Sc-Nramp2)基因克隆及其在副溶血弧菌刺激下的表达分析

克隆得到缢蛏天然抗性相关巨噬蛋白2（Sc-Nramp2）基因的cDNA全长序列3 681 bp,该基因的开放阅读框有1 776 bp,编码591个氨基酸,预测分子量为65.86 kDa;其结构具有Slc11蛋白家族的典型特征,包括有10个典型的跨膜结构和2个糖基化位点。Sc-Nramp2基因3'-UTR有2个类似于脊椎动物Nramp2中铁反应控制蛋白结合位点;同源性分析表明,Sc-Nramp2和太平洋牡蛎Nramp2-like的同源性最高为71.6%。实时荧光定量PCR结果表明,Sc-Nramp2基因在闭壳肌、外套膜、肝胰腺、斧足、水管和鳃6个组织中均有表达,其中肝胰腺中的表达量最高,其次是鳃,与其他组织均有极显著性差异（P<0.01）;注射副溶血弧菌后,肝胰腺中Sc-Nramp2基因的表达量较对照组显著上调（P<0.01）,且表达量呈现先上升后下降的趋势,在12 h时达到最大表达量,推测Sc-Nramp2基因参与了缢蛏非特异性免疫应答反应。     

厚壳贻贝(Mytilus coruscus)Hox基因家族的鉴定、进化与表达分析

为探究厚壳贻贝Hox基因家族的定位、进化以及在不同成体组织中的表达模式,基于厚壳贻贝全基因组数据,结合生物信息学方法,鉴定分析厚壳贻贝Hox基因家族成员的理化性质、染色体分布、系统进化关系、基因结构以及表达分析。结果显示,从厚壳贻贝全基因组数据中鉴定出11条Hox基因序列,并分别命名为Hox1-5、Antp、Lox2、Lox4、Lox5、Post1、Post2。对11条Hox序列的基本特征分析发现最长的是编码703个氨基酸的Hox2,最短的是编码190个氨基酸Post2,等电点5.11～10.22,且不均等分布于同一条染色体上。亚细胞定位预测结果显示,除Post1基因在细胞质和细胞核中均有发现,其余10个基因亚细胞均定位在细胞核内。系统进化分析发现,使用厚壳贻贝中鉴定出的101条氨基酸序列进行建树,聚类的结果倾向于四类,而从已鉴定的厚壳贻贝11个基因结合软体动物Hox建树结果分析, Post1和Post2聚为一支, Hox4、Antp、Lox5、Lox2和Lox4聚为一个大类,Hox1、Hox2和Hox3各自聚为一类Hox,此外,Hox5单独聚为一类。厚壳贻贝不同组织的qRT-PCR结...     

Piwi基因参与两性卤虫(Artemia franciscana)的生殖调控研究

Piwi（P-element induced wimpy testis）基因编码Piwi蛋白,在生殖干细胞的自我更新、减数分裂过程、RNA沉默和转录调控中起重要作用。为探究Piwi基因参与两性卤虫生殖发育的作用,从两性卤虫Artemia franciscana转录组中筛选获得Piwi基因开放阅读框,进行序列分析和结构域预测等生物信息学分析,采用qPCR技术研究该基因在A.franciscana生殖腺发育不同时期表达特征,并利用RNAi显微注射技术探究其功能。生物信息学分析表明,A.franciscana Piwi基因的开放阅读框长2 619 bp,编码872个氨基酸;Piwi基因编码的蛋白分子量为98.11 kDa,等电点为9.50,为碱性亲水性蛋白,无信号肽和跨膜结构;存在Piwi和PAZ结构域及ArgoL1结构域,二级结构以α-螺旋为主,三级结构与之对应;系统进化树显示A.franciscana与蚤状溞和大型溞的Piwi序列相似性最高。qPCR结果表明,Piwi基因在卵巢的卵黄发生晚期和晚期胚胎表达量最高,显著高于卵黄发生早期和早期胚胎（P<0.01）;Piwi基因在精巢的未成熟期表达量最高,显著高于成熟早期、成熟中期和成熟晚期（P<0.01）。RNAi结果显示,该方法能显著降低Piwi基因的表达水平（P<0.01）,并导致A.franciscana所产后代均为休眠卵,说明Piwi基因不但在A.franciscana生殖发育调控起重要作用,而且可能在其繁殖方式决定过程中起关键作用。研究结果为两性卤虫Piwi/piRNA功能和分子机制调控的研究提供了基础信息,将有助于揭示Piwi基因参与调控两性卤虫生殖发育机制。     

蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa) Rubisco活化酶基因的克隆与表达分析

采用RACE技术克隆了单细胞绿藻蛋白核小球藻820Rubisco活化酶基因(rca)序列,并用荧光定量PCR方法研究了rca和Rubisco小亚基基因(rbcS)的表达规律。结果获得了1703bp的rcacDNA序列,包括66bp的5’非翻译区、1242bp的开放阅读框和395bp的3’非翻译区。序列比较和分析表明该蛋白核小球藻rca序列与其它绿藻的同源性高达78%—85%;偏好使用以G/C/T结尾的密码子;推测的RCA蛋白等电点和分子量分别为8.44和45.71kDa。荧光定量PCR结果表明随光照时间增加rca与rbcS转录表达逐渐降低;不同盐度处理下rbcS的mRNA量变化不大,而rca在37.5盐度下表达量为25盐度的2.69倍;1.0—3.0mmol/L水杨酸处理rca与rbcS表达均降低。     

基于脂质组学的海洋颗石藻病毒甾醇去饱和酶及脂肪酸去饱和酶基因功能分析

赫氏颗石藻(Emiliania huxleyi)宿主-病毒(E.huxleyi virus,EhV)的互作过程是影响海洋碳、硫生物地球化学循环及气候变化的重要环节。在共进化过程中,Eh V通过基因水平转移从宿主基因组中“劫获”了一组鞘脂从头合成相关酶基因,重构宿主脂代谢网络以支持病毒的特殊需求。目前,对病毒这组相关酶基因的生物学功能尚不十分清楚。以颗石藻病毒Eh V-99B1基因组中的甾醇去饱和酶(EhV-SD)和脂肪酸去饱和酶(Eh V-FAD)基因为研究对象,构建酿酒酵母重组表达载体p YES2/CT-SD和p YES2/CT-FAD,转化相应的基因缺陷型酵母菌株YMR015C和YGL055W获得重组酵母细胞株,进一步采用UPLC-Q-Exactive-MS非靶向脂质组学技术,比较分析重组酵母和缺陷型酵母细胞脂质的组成和含量变化。结果显示,Eh V-SD与Eh V-FAD基因在酿酒酵母中成功表达并具有生物学活性。Eh V-SD过表达显著改变了重组酵母细胞脂质代谢,含多不饱和酰基链的磷脂酰胆碱(PC,20︰4/20︰5/20︰6)和甘油三酯(TAG,12︰3)种类的丰度显著升高;而部...