不同温度下马氏珠母贝干露耐受能力及其免疫相关基因表达的变化

【目的】探究马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)对干露胁迫的响应,为马氏珠母贝健康养殖和遗传育种提供基础资料。【方法】在不同温度下对马氏珠母贝进行干露胁迫,探究温度对马氏珠母贝干露耐受的影响;筛选出马氏珠母贝干露胁迫敏感组和耐受组,比较两组的免疫相关基因表达量和植核后休养期存活率。【结果】(1)22~34℃条件下,马氏珠母贝干露耐受能力随温度升高及干露时间延长而降低;(2)22℃下,S组和T组的脯氨酸羟化酶(PHD)、葡萄糖转运蛋白(GLUT)、髓样分化因子(MYD88)、热休克蛋白(Hsp70、Hsp20)和凋亡抑制因子(cIAP)6个基因在干露过程中表达量基本呈上升趋势,组间差异显著(P<0.05);(3)植核试验结果表明耐受组植核后休养期的存活率显著高于敏感组(P<0.05)。【结论】马氏珠母贝在高温环境下干露耐受能力降低,在适温条件下耐受组比敏感组表现出较高的存活率。     

马氏珠母贝Perlucin基因序列特征及其SNP与耐低温性状的关系

【目的】克隆马氏珠母贝（Pinctada fucata martensii）新的凝集素分子基因,命名为Perlucin,研究在低温胁迫下马氏珠母贝Perlucin的表达以及与抗低温性状相关的单核苷酸多态性（SNP）位点。【方法】根据马氏珠母贝基因组中Perlucin基因序列设计引物,克隆Perlucin基因全长;用生物信息学方法分析Perlucin的结构和理化特征;设计17和22℃（对照）2个温度组,对马氏珠母贝进行低温胁迫实验,用实时荧光定量PCR检测低温胁迫下Perlucin表达量的变化;筛选和比较分析马氏珠母贝耐低温选育系（R）F3和北部湾野生群体（W）的Perlucin外显子区的SNP位点和单倍型。【结果】马氏珠母贝Perlucin全长631 bp,编码152个氨基酸;包含1个信号肽和1个C型凝集素结构域。同源分析表明,马氏珠母贝Perlucin与紫贻贝（Mytilus galloprovincialis）Perlucin的亲缘性最近。Perlucin在鳃中表达量最高,其次为足和肝胰腺。低温胁迫时,鳃组织中Perlucin基因在17℃低温组的表达量呈先升高后降低的趋势,在12 ...     

Janus激酶3抑制剂对马氏珠母贝珍珠囊发育和免疫相关基因表达的影响

【目的】研究JAK3抑制剂对珍珠囊发育及移植免疫反应的影响。【方法】以马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)为材料,植核前用JAK3抑制剂处理细胞小片和珠核,植核后18 d和30 d取珍珠囊,用石蜡切片技术和H.E.染色法(Hematoxylin-eosin Staining)观察JAK3抑制剂对珍珠囊发育的影响,利用荧光定量技术检测植核后不同时间(6、12、24 h和3、6、12、18、30 d)免疫相关基因NF-kappaB(Nuclear factor kappa B)、IkappaK(I-kappaB kinase)和炎性诱导因子IL-17(Interleukin 17)的表达变化。【结果】植核后18 d和30 d,与对照组相比,JAK3抑制剂对珍珠囊的发育没有显著影响(P> 0.05)。荧光定量结果显示,植核后6 h和12 h,JAK3抑制剂可以显著性抑制IL-17的表达,植核后6、3、6、12 d,JAK3抑制剂可以显著性抑制NF-kappaB的表达,植核后3、6 d,JAK3抑制剂可以显著性抑制IkappaK的表达(P <0.05)。【结论】JAK3抑制剂对马氏珠母贝免疫基因表达有明显的抑制作用,可以有效调控珍珠贝植核后的移植免疫,而对珍珠囊发育的影响不明显。     

术后处理对马氏珠母贝育珠贝产珠性能的影响

【目的】为提高马氏珠母贝的育珠效益,比较海水盐度、抗生素和休养方式对马氏珠母贝育珠贝成活率、留核率和优良珠率的影响。【方法】实验1,设置休养海水盐度为22.5、25.1和27.8,以天然海水盐度31.7为对照组;实验2,休养期间,分别使用青霉素和链霉素、盐酸环丙沙星、头孢克肟和硫酸庆大霉素,手术第1天用量为10 mg·L~(-1),植核手术后1 d起使用量为5 mg·L~(-1),连续使用5 d;实验3,分别在室内水池、池塘和天然海区进行马氏珠母贝的术后休养,研究不同术后处理方式对育珠贝产珠性能的影响。【结果与结论】低盐度海水休养对马氏珠母贝育珠贝的优良珠率影响有统计学意义(P 0.05),但对育珠贝成活率和留核率影响无统计学意义(P0.05);休养期间使用抗生素对马氏珠母贝育珠贝的成活率、留核率和优良珠率影响无统计学意义(P0.05);休养方式对育珠贝的成活率和留核率影响有统计学意义(P 0.05),水池休养的育珠贝成活率和留核率最高,海区休养的育珠贝最低。     

马氏珠母贝TRADD基因克隆与组织表达分析

【目的】克隆马氏珠母贝(Pinctada martensii)肿瘤坏死因子受体相关死亡域蛋白(TRADD)基因,并分析其在各组织中的表达。【方法】利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得马氏珠母贝PmTRADD基因的c DNA全长序列,利用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析PmTRADD基因在马氏珠母贝不同组织中的表达模式。【结果与结论】PmTRADD包含5′非编码区101 bp,3′非编码区144 bp和开放阅读框(ORF)591 bp,编码196个氨基酸。序列分析表明,PmTRADD没有信号肽和跨膜结构域,C端含有一个死亡结构域(DEATH)。将PmTRADD死亡结构域的氨基酸序列与其他物种的TRADD死亡结构域序列进行比对,发现不同物种的TRADD死亡结构域序列同源性较低。PmTRADD在马氏珠母贝各组织中均有不同程度表达,在鳃组织中表达最高,肝胰腺次之,闭壳肌中基本无表达。     

引进印尼种大珠母贝繁育F1母贝植核育珠研究

以印度尼西亚引进大珠母贝亲本繁育的子代F1群体进行植核育珠,育珠贝数量8086只,在海区休养20d后,统计育珠母贝的成活率与留核率,比较3月与4月植核手术育珠贝的育珠性状差异。结果表明：休养期结束后,育珠贝的成活率与留核率分别为97.57％和90.69％;育珠期3个月时（6月17日）育珠贝的成活率为81.22％;4月植核育珠母贝的留核率与成活率明显高于在3月的植核育珠母贝,但两者之间差异不具统计学意义（P〉0.05）。     

马氏珠母贝接头蛋白CIKS的基因克隆与组织表达分析

【目的】探究马氏珠母贝接头蛋白CIKS(PmCIKS)在马氏珠母贝免疫反应中的作用。【方法】采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得PmCIKS基因cDNA全长序列,运用生物信息学手段分析该序列,用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测PmCIKS基因在马氏珠母贝7个组织中的表达模式。【结果】PmCIKS基因cDNA全长为1 987 bp,其中5′UTR长为228 bp,3′UTR长为148 bp,包含24 bp的ploy A,开放阅读框(ORF)为1 611 bp,编码536个氨基酸,预测其分子质量约为61.3 ku,等电点为7.01。物种间CIKS有较高的保守性。PmCIKS在马氏珠母贝肝胰腺、性腺、闭壳肌、鳃、血细胞、外套膜和足中均有表达,其中在血细胞中表达量最高。     

脂多糖刺激对马氏珠母贝血细胞DNA甲基化修饰的影响

【目的】研究马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)血细胞基因组DNA的甲基化修饰情况及其在脂多糖(LPS)刺激后的变化,为探究甲基化修饰在珍珠贝免疫防御中的作用提供理论基础。【方法】运用甲基化敏感扩增多态性法(MSAP)分析马氏珠母贝血细胞(正常养殖贝)以及注射LPS后(6、12、24 h)基因组CCGG位点甲基化的修饰水平变化,并对甲基化修饰位点进行回收测序。【结果】共获得1 102个清晰可辨的DNA条带,其中全甲基化位点条带215个,半甲基化位点条带127个,非甲基化位点条带760个。对照组血细胞基因组CCGG位点的甲基化修饰比例为23.76%,注射LPS后,甲基化比例为28.10%～48.25%,注射6 h时最低,12 h时最高;对特异性片段测序后,经Blast比对,得到5条存在甲基化修饰的基因序列,其中2条具有注释信息,分别是干扰素调控因子(Interferon regulatory factor)和磷脂酶BL2(Putative phospholipase B-like 2)。【结论】马氏珠母贝血细胞基因组CCGG位点的甲基化修饰参与调控LPS诱导的免疫反应,在免疫防御中发挥重要作用。     

马氏珠母贝PmFAMeT基因的克隆及表达

【目的】克隆马氏珠母贝(Pinctada martensii)法尼酸甲基转移酶(FAMe T)基因,并分析其在各组织中的表达。【方法】利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得马氏珠母贝FAMeT(PmFAMeT)基因的cDNA全长序列,利用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析PmFAMeT在马氏珠母贝不同组织中的表达模式。【结果与结论】PmFAMeT包含5′非编码区120 bp,3′非编码区968 bp和开放阅读框(ORF)1 536 bp,编码511个氨基酸。序列分析表明,PmFAMeT含有信号肽序列和跨膜结构域,并有WSC结构域、TSP1结构域和2个Methyltransf_FA结构域。将推导的PmFAMeT氨基酸序列与其他物种的FAMeT序列进行比对发现,不同物种的Methyltransf_FA序列同源性较高。PmFAMeT在马氏珠母贝的各个组织中均有表达,且在边缘膜、肝胰腺和性腺中的表达量显著高于其他组织。     

3种珍珠贝精子发生及其超微结构的比较研究

在透射电子显微镜下观察合浦珠母贝（Ｐｉｎｃｔａｄａｆｕｃａｔａ）、大珠母贝（Ｐｉｎｃｔａｄａｍａｘｉｍａ）和企鹅珍珠贝（Ｐｔｅｒｉａｐｅｎｇｕｉｎ）的精子发生及精子形态．结果表明．大珠母贝从精原细胞到精子，核内都有数量不等的板层小体（ｎｕｃｌｅａｒｌａｍｅｌｌａｒｂｏｄｙ）；企鹦珍珠贝从精原细胞的晚期直到精子细胞早期，大多数细胞出现核内包含体（ｎｕｃｌｅａｒｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）；而合浦珠母贝的生精细胞核无特殊结构．合浦珠母贝在初级精母细胞时由高尔基体分泌形成前顶体粒；企鹅珍珠贝的前顶体粒主要在次级精母细胞和早期精子细胞阶段形成。虽然大珠母贝的各级生精细胞中都没有出现典型的高尔基体，但前顶体粒仍在精母细胞时期形成。三种贝的精子结构均为典型的原生型，由头部、中段和尾部构成．合浦珠母贝精子的顶体最长，中段的线粒体数有变异；大珠母贝的精子核最高，其中含有板层小体；而企鹅珍珠贝精子中段的体积是最大的．     

马氏珠母贝DNA甲基化转移酶Dnmt1的克隆及表达

【目的】对马氏珠母贝(Pinctada martensii)DNA甲基化转移酶1(DNA methyltransferase 1,Dnmt1)的基因全长及组织表达作分析,探究马氏珠母贝甲基转移酶Dnmt1(PmDnmt1)参与贝壳矿化调控机理。【方法】利用RACE技术获得PmDnmt1的c DNA序列全长,并对PmDnmt1的序列特征进行分析,同时利用逆转录-聚合酶链反应RT-PCR技术检测马氏珠母贝不同组织中PmDnmt1的表达情况。【结果与结论】PmDnmt1基因c DNA长4 818 bp,其中,开放阅读框为4 623 bp,编码1 540个氨基酸。预测分子质量约为174.55 ku、理论等电点为5.89。结构域分析显示,PmDnmt1具有DMAP结合结构域、DNMT1-RFD结构域、锌指结构、BAH结构域和C5胞嘧啶DNA甲基化酶结构域等。多序列比对结果发现,Dnmt1在不同物种间具有较高保守性。实时荧光定量PCR分析显示PmDnmt1在所有检测组织中均有表达,在外套膜中央膜部分的表达量最高(P 0.05)。PmDnmt1可通过调控外套膜的DNA甲基化修饰参与贝壳的形成。     

马氏珠母贝TRACP基因的克隆及组织表达

【目的】克隆马氏珠母贝(Pinctada martensii)抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase,TRACP)基因,分析该基因在不同组织中的表达模式。【方法】用RACE技术克隆得马氏珠母贝TRACP基因(PmTRACP),用实时荧光定量PCR分析该基因在外套膜、闭壳肌、足、性腺、珍珠囊、肝胰腺和鳃中的表达。【结果与结论】PmTRACP基因长度为2 034 bp,开放式阅读框972 bp,编码323个氨基酸,5′UTR长度为27 bp,3′UTR长度为1 035 bp。预测PmTRACP分子质量约为36.39 ku,理论等电点为5.97。该基因含有一个钙调神经磷酸酶样磷酸酯酶结构域。PmTRACP与其他物种TRACP的同源性为48%～65%,与长牡蛎(Crassostrea gigas)TRACP的同源性最高,同时D~(32)、D~(70)、Y~(73)、N~(108)、H~(203)、H~(212)、H~(237)、H~(239)等8个氨基酸活性位点和N~(114)糖基化位点在不同物种TRACP中高度保守。PmTRACP与长牡蛎TRACP的亲缘关系最近。PmTRACP在马氏珠母贝各个组织均有表达,且在肝胰腺和珍珠囊中高表达。     

珍珠囊发育中马氏珠母贝血清免疫因子的变化规律

马氏珠母贝育珠贝插核手术后的第1、第2、第3、第10、第15、第20、第30和第60天,抽取育珠贝血清,并研究其非特异性免疫因子酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和溶菌酶(LSZ)的活性变化。结果表明:在珍珠囊发育初期(插核后3～10d),育珠贝血清的免疫因子ACP、AKP、CAT、SOD均比对照组(未经插核的马氏珠母贝)显著性增大(P<0.05),LSZ在插核后1～3d比对照组LSZ活性显著性增大(P<0.05);在珍珠囊发育中期(插核后第15～20天),各种免疫酶活性都逐渐降低;珍珠囊发育后期(插核30d后),育珠贝血清中的各种免疫酶活性都已恢复到对照组水平。     

马氏珠母贝β2肾上腺素能受体(β2AR)分子特征和表达分析

【目的】研究马氏珠母贝(Pinctada martensii)β2肾上腺素能受体(Pmβ2AR)的生物学功能。【方法】利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得Pmβ2AR基因的cDNA的全长序列并对其序列特征进行分析,实时荧光定量技术(q RT-PCR)检测马氏珠母贝不同组织中β2AR基因m RNA的表达水平。【结果与结论】Pmβ2AR的cDNA全长2 426 bp,包括开放阅读框(ORF)2 091 bp,编码696个氨基酸,5′UTR长144 bp,3′UTR长191bp,预测分子质量79.0 ku,理论等电点9.18,多重序列比对结果发现β2AR在不同物种间的保守性较高。软件分析结果显示Pmβ2AR的氨基酸序列具有7个典型的跨膜结构域。q RT-PCR结果表明,Pmβ2AR基因在各组织中均有表达,在鳃中表达量最高,在肝胰腺和性腺中表达量也较高。     

马氏珠母贝贝壳基质蛋白基因Pm-PNU7的克隆和功能研究

【目的】研究马氏珠母贝(Pinctada martensii)贝壳基质蛋白(Shell Matrix Proteins, SMPs)基因(Pm-PNU7)表达与功能。【方法】利用马氏珠母贝基因组和蛋白质组信息分析和RACE技术克隆获得壳基质蛋白新基因Pm-PNU7全长序列,通过原位杂交对其进行定位,RNA干扰检测其对贝壳形成的影响。【结果】Pm-PNU7的cDNA全长为797 bp,编码145个氨基酸,具有特殊的"KGG"重复序列和富含天冬氨酸(Asp)序列"DDDDDDHDD"。qRT-PCR分析表明,Pm-PNU7基因在外套膜边缘区和套膜区显著高表达(P0.05);ISH检测显示,Pm-PNU7主要定位于边缘区外褶外侧和内侧上皮细胞、中褶内侧上皮细胞以及套膜区外侧上皮细胞。RNA干扰后,Pm-PNU7在外套膜边缘区和套膜区的表达量均显著下调,贝壳棱柱层和珍珠层微观结构均出现不同程度的紊乱。【结论】Pm-PNU7参与了贝壳棱柱层和珍珠层的形成。     

马氏珠母贝外套膜中央膜与边缘膜荧光定量PCR分析中内参基因的筛选

为筛选能在马氏珠母贝外套膜边缘膜与中央膜区域稳定表达的内参基因,应用荧光定量PCR 技术,对3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、β-肌动蛋白（β-actin）、胆色素原脱氨酶（PBGD）、微管蛋白（TUB）、TATA 盒结合蛋白（TBP）、磷脂酶A2（PLA-2）、葡萄糖苷酶（GUSB）、18S 核糖体rRNA（18SrRNA）等8 个常用的内参基因在马氏珠母贝外套膜边缘膜与中央膜区域的表达情况进行分析,并利用geNorm、NormFinder、BestKeeper 及RefFinder 软件对8 个内参基因的表达稳定性进行分析.结果表明：8 个内参基因均可获得特异性扩增产物,但稳定性各异, 其在外套膜边缘膜和中央膜区的表达稳定性顺序依次为PBGD/TBP〉TUB〉GUSB〉18SrRNA〉PLA-2〉GAPDH〉 β-actin;在荧光定量PCR 中,PBGD 和TBP 在马氏珠母贝外套膜边缘膜和中央膜区的表达比较稳定,为研究贝壳矿化机制中理想的内参基因.     

马氏珠母贝育珠效果影响因素分析

设立3个实验,分别比较了植核时间、植核贝龄、育珠模式对马氏珠母贝育珠效果影响。实验I,设立A1、A2和A3组,植核时间分别设置4月份、7月份和10月份;实验II,设立B1、B2、B3和B4组,植核贝龄分别设置1.0龄、1.5龄、2.0龄和2.5龄;实验III,设立C1、C2和C3组,育珠模式分别设置海区休养与育珠、池塘休养与育珠和池塘休养与海区育珠。按常规技术植核,经1个月的休养期和15个月的育珠结束后,比较各组间休养与育珠的成活率、留核率、成珠率、优良珠率及育珠绩效值的差异。结果表明:植核时间、植核贝龄、育珠模式对植核贝的成活率和育珠绩效值均存在显著的影响(p值<0.05);对育珠贝的留核率、收珠率和优良珠率无显著性影响(p值>0.05);实验I,A1组(4月份植核)育珠绩效值最高,A2组(7月份植核)育珠绩效值最低;实验II,B2(1.5龄)育珠绩效值最高,B4组(2.5龄)育珠绩效值最低;实验III,C3组(池塘休养与海区育珠)的育珠绩效值最高,C2组(池塘休养与育珠)育珠绩效值最低。马氏珠母贝适宜的植核时间为4月份,适宜的植核贝龄为1.5龄,利用池塘休养结合海区育珠能够有效提高育珠效果。     

合浦珠母贝丝氨酸蛋白酶抑制因子基因pfser1克隆与表达

【目的】克隆合浦珠母贝(Pinctada fucata)丝氨酸蛋白酶抑制因子pfser1基因,探讨该基因的组织表达及其在天然免疫过程中的作用,以及与生物矿化过程的关系。【方法】通过RACE技术获得pfser1基因的全长,通过生物信息学分析其序列结构特征,利用实时荧光定量PCR方法检测pfser1基因在不同组织中的表达,检测健康合浦珠母贝在被大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655刺激后和在贝壳损伤修复实验中pfser1基因表达量的变化。【结果】合浦珠母贝pfser1基因cDNA全长为1240 bp,包含1035 bp的开放阅读框(ORF),编码344个氨基酸,氨基酸序列的功能结构域含有丝氨酸蛋白酶抑制因子Serpin家族保守结构域。pfser1基因在合浦珠母贝各个组织中均有表达,在外套膜边缘膜中表达量最高;大肠杆菌MG1655刺激后,该基因表达量显著升高;在贝壳损伤修复过程中,pfser1基因表达先升高后受到抑制。【结论】pfser1基因所表达的蛋白参与了合浦珠母贝的天然免疫应答过程,并与生物矿化过程有一定关系。     

马氏珠母贝Pm-miR-183序列分析及功能研究

用马氏珠母贝基因组序列,通过生物信息学方法获得Pm-miR-183的前体,长度76 bp,具有典型的茎环结构。成熟序列及前体序列的同源性分析均显示较高的种间保守性。Pm-miR-183前体序列(Pm-pre-miR-183)的系统进化树分析,Pm-pre-miR-183与帽贝同源性较高。靶向关系分析,Pm-miR-183与矿化基因及免疫相关基因均存在靶向作用位点。实时荧光定量分析,Pm-miR-183在马氏珠母贝的各组织中均有表达。注射Pm-miR-183mimics进行过表达,Pm-miR-183的表达量在套膜区(MP)中显著上调(P0.05)。扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)检测,Pm-miR-183过表达会导致贝壳珍珠层生长出现紊乱。     

马氏珠母贝细胞周期分裂基因CDC45基因特征、表达量与性状相关分析

采用RACE技术克隆了马氏珠母贝细胞周期分裂基因45(Pm-CDC45)全长序列,利用荧光定量PCR检测该基因在闭壳肌、鳃、性腺与外套膜组织的表达量,并估计基因表达量与金黄壳色第3代选育群体壳高性状的相关性。结果表明:Pm-CDC45基因序列全长为2 091 bp,5′非编码区(5′UTR)为157 bp,3′非编码区(3′UTR)为34 bp,其中开放阅读框为1 967 bp,编码655个氨基酸;Pm-CDC45在各组织的相对表达量存在显著差异(P0.05),其中闭壳肌表达量最高,鳃和性腺为其次,外套膜最低;Pm-CDC45基因相对表达量与选育群体壳高性状与存在显著的正相关(r=0.531,P0.05);马氏珠母贝Pm-CDC45为影响壳高性状基因。