马氏珠母贝接头蛋白CIKS的基因克隆与组织表达分析

【目的】探究马氏珠母贝接头蛋白CIKS(PmCIKS)在马氏珠母贝免疫反应中的作用。【方法】采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得PmCIKS基因cDNA全长序列,运用生物信息学手段分析该序列,用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测PmCIKS基因在马氏珠母贝7个组织中的表达模式。【结果】PmCIKS基因cDNA全长为1 987 bp,其中5′UTR长为228 bp,3′UTR长为148 bp,包含24 bp的ploy A,开放阅读框(ORF)为1 611 bp,编码536个氨基酸,预测其分子质量约为61.3 ku,等电点为7.01。物种间CIKS有较高的保守性。PmCIKS在马氏珠母贝肝胰腺、性腺、闭壳肌、鳃、血细胞、外套膜和足中均有表达,其中在血细胞中表达量最高。     

琥珀酰化修饰对马氏珠母贝植核免疫的影响

【目的】研究蛋白质琥珀酰化修饰在马氏珠母贝（Pinctada fucata martensii）植核后免疫应答中的作用,为阐明珍珠贝植核反应的分子调控机制提供理论依据。【方法】通过对马氏珠母贝注射琥珀酸钠模拟提高琥珀酰化修饰水平,检测马氏珠母贝植核后鳃组织总蛋白琥珀酰化程度、免疫相关基因表达、抗氧化相关酶酶活以及珍珠贝的存活率和留核率。【结果与结论】注射琥珀酸钠后,鳃组织琥珀酰化修饰水平在12 h和72 h显著上升;使用实时荧光定量PCR检测胁迫应激相关基因的时序表达,胁迫应激相关因子SOD和Caspase2在6 h表达量显著上调,NF-κB和IRAK1在48 h表达量显著上调,TRAF3和IκK的表达量在96 h显著上调（P <0.05）,表明琥珀酰化修饰水平提高后受体贝机体细胞免疫增强;抗氧化相关酶、过氧化物酶和谷胱甘肽活性都在96 h出现显著上调（P <0.05）,表明受体贝体液免疫增强。与对照组[磷酸盐缓冲溶液（PBS）+植核]和植核组相比,实验组（琥珀酸钠+植核）中珍珠贝的存活率在7 d和45 d存在显著差异,在60 d留核率显著上升（P <0.05）。结果...     

马氏珠母贝TRADD基因克隆与组织表达分析

【目的】克隆马氏珠母贝(Pinctada martensii)肿瘤坏死因子受体相关死亡域蛋白(TRADD)基因,并分析其在各组织中的表达。【方法】利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得马氏珠母贝PmTRADD基因的c DNA全长序列,利用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析PmTRADD基因在马氏珠母贝不同组织中的表达模式。【结果与结论】PmTRADD包含5′非编码区101 bp,3′非编码区144 bp和开放阅读框(ORF)591 bp,编码196个氨基酸。序列分析表明,PmTRADD没有信号肽和跨膜结构域,C端含有一个死亡结构域(DEATH)。将PmTRADD死亡结构域的氨基酸序列与其他物种的TRADD死亡结构域序列进行比对,发现不同物种的TRADD死亡结构域序列同源性较低。PmTRADD在马氏珠母贝各组织中均有不同程度表达,在鳃组织中表达最高,肝胰腺次之,闭壳肌中基本无表达。     

不同温度下马氏珠母贝干露耐受能力及其免疫相关基因表达的变化

【目的】探究马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)对干露胁迫的响应,为马氏珠母贝健康养殖和遗传育种提供基础资料。【方法】在不同温度下对马氏珠母贝进行干露胁迫,探究温度对马氏珠母贝干露耐受的影响;筛选出马氏珠母贝干露胁迫敏感组和耐受组,比较两组的免疫相关基因表达量和植核后休养期存活率。【结果】(1)22~34℃条件下,马氏珠母贝干露耐受能力随温度升高及干露时间延长而降低;(2)22℃下,S组和T组的脯氨酸羟化酶(PHD)、葡萄糖转运蛋白(GLUT)、髓样分化因子(MYD88)、热休克蛋白(Hsp70、Hsp20)和凋亡抑制因子(cIAP)6个基因在干露过程中表达量基本呈上升趋势,组间差异显著(P<0.05);(3)植核试验结果表明耐受组植核后休养期的存活率显著高于敏感组(P<0.05)。【结论】马氏珠母贝在高温环境下干露耐受能力降低,在适温条件下耐受组比敏感组表现出较高的存活率。     

马氏珠母贝β2肾上腺素能受体(β2AR)分子特征和表达分析

【目的】研究马氏珠母贝(Pinctada martensii)β2肾上腺素能受体(Pmβ2AR)的生物学功能。【方法】利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得Pmβ2AR基因的cDNA的全长序列并对其序列特征进行分析,实时荧光定量技术(q RT-PCR)检测马氏珠母贝不同组织中β2AR基因m RNA的表达水平。【结果与结论】Pmβ2AR的cDNA全长2 426 bp,包括开放阅读框(ORF)2 091 bp,编码696个氨基酸,5′UTR长144 bp,3′UTR长191bp,预测分子质量79.0 ku,理论等电点9.18,多重序列比对结果发现β2AR在不同物种间的保守性较高。软件分析结果显示Pmβ2AR的氨基酸序列具有7个典型的跨膜结构域。q RT-PCR结果表明,Pmβ2AR基因在各组织中均有表达,在鳃中表达量最高,在肝胰腺和性腺中表达量也较高。     

马氏珠母贝PmFAMeT基因的克隆及表达

【目的】克隆马氏珠母贝(Pinctada martensii)法尼酸甲基转移酶(FAMe T)基因,并分析其在各组织中的表达。【方法】利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得马氏珠母贝FAMeT(PmFAMeT)基因的cDNA全长序列,利用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析PmFAMeT在马氏珠母贝不同组织中的表达模式。【结果与结论】PmFAMeT包含5′非编码区120 bp,3′非编码区968 bp和开放阅读框(ORF)1 536 bp,编码511个氨基酸。序列分析表明,PmFAMeT含有信号肽序列和跨膜结构域,并有WSC结构域、TSP1结构域和2个Methyltransf_FA结构域。将推导的PmFAMeT氨基酸序列与其他物种的FAMeT序列进行比对发现,不同物种的Methyltransf_FA序列同源性较高。PmFAMeT在马氏珠母贝的各个组织中均有表达,且在边缘膜、肝胰腺和性腺中的表达量显著高于其他组织。     

马氏珠母贝细胞周期分裂基因CDC45基因特征、表达量与性状相关分析

采用RACE技术克隆了马氏珠母贝细胞周期分裂基因45(Pm-CDC45)全长序列,利用荧光定量PCR检测该基因在闭壳肌、鳃、性腺与外套膜组织的表达量,并估计基因表达量与金黄壳色第3代选育群体壳高性状的相关性。结果表明:Pm-CDC45基因序列全长为2 091 bp,5′非编码区(5′UTR)为157 bp,3′非编码区(3′UTR)为34 bp,其中开放阅读框为1 967 bp,编码655个氨基酸;Pm-CDC45在各组织的相对表达量存在显著差异(P0.05),其中闭壳肌表达量最高,鳃和性腺为其次,外套膜最低;Pm-CDC45基因相对表达量与选育群体壳高性状与存在显著的正相关(r=0.531,P0.05);马氏珠母贝Pm-CDC45为影响壳高性状基因。     

马氏珠母贝TRACP基因的克隆及组织表达

【目的】克隆马氏珠母贝(Pinctada martensii)抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase,TRACP)基因,分析该基因在不同组织中的表达模式。【方法】用RACE技术克隆得马氏珠母贝TRACP基因(PmTRACP),用实时荧光定量PCR分析该基因在外套膜、闭壳肌、足、性腺、珍珠囊、肝胰腺和鳃中的表达。【结果与结论】PmTRACP基因长度为2 034 bp,开放式阅读框972 bp,编码323个氨基酸,5′UTR长度为27 bp,3′UTR长度为1 035 bp。预测PmTRACP分子质量约为36.39 ku,理论等电点为5.97。该基因含有一个钙调神经磷酸酶样磷酸酯酶结构域。PmTRACP与其他物种TRACP的同源性为48%～65%,与长牡蛎(Crassostrea gigas)TRACP的同源性最高,同时D³²、D⁷⁰、Y⁷³、N¹⁰⁸、H²⁰³、H²¹²、H²³⁷、H²³⁹等8个氨基酸活性位点和N¹¹⁴糖基化位点在不同物种TRACP中高度保守。PmTRACP与长牡蛎TRACP的亲缘关系最近。PmTRACP在马氏珠母贝各个组织均有表达,且在肝胰腺和珍珠囊中高表达。     

合浦珠母贝丝氨酸蛋白酶抑制因子基因pfser1克隆与表达

【目的】克隆合浦珠母贝(Pinctada fucata)丝氨酸蛋白酶抑制因子pfser1基因,探讨该基因的组织表达及其在天然免疫过程中的作用,以及与生物矿化过程的关系。【方法】通过RACE技术获得pfser1基因的全长,通过生物信息学分析其序列结构特征,利用实时荧光定量PCR方法检测pfser1基因在不同组织中的表达,检测健康合浦珠母贝在被大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655刺激后和在贝壳损伤修复实验中pfser1基因表达量的变化。【结果】合浦珠母贝pfser1基因cDNA全长为1240 bp,包含1035 bp的开放阅读框(ORF),编码344个氨基酸,氨基酸序列的功能结构域含有丝氨酸蛋白酶抑制因子Serpin家族保守结构域。pfser1基因在合浦珠母贝各个组织中均有表达,在外套膜边缘膜中表达量最高;大肠杆菌MG1655刺激后,该基因表达量显著升高;在贝壳损伤修复过程中,pfser1基因表达先升高后受到抑制。【结论】pfser1基因所表达的蛋白参与了合浦珠母贝的天然免疫应答过程,并与生物矿化过程有一定关系。     

马氏珠母贝贝壳基质蛋白基因Pm-PNU7的克隆和功能研究

【目的】研究马氏珠母贝(Pinctada martensii)贝壳基质蛋白(Shell Matrix Proteins, SMPs)基因(Pm-PNU7)表达与功能。【方法】利用马氏珠母贝基因组和蛋白质组信息分析和RACE技术克隆获得壳基质蛋白新基因Pm-PNU7全长序列,通过原位杂交对其进行定位,RNA干扰检测其对贝壳形成的影响。【结果】Pm-PNU7的cDNA全长为797 bp,编码145个氨基酸,具有特殊的"KGG"重复序列和富含天冬氨酸(Asp)序列"DDDDDDHDD"。qRT-PCR分析表明,Pm-PNU7基因在外套膜边缘区和套膜区显著高表达(P<0.05);ISH检测显示,Pm-PNU7主要定位于边缘区外褶外侧和内侧上皮细胞、中褶内侧上皮细胞以及套膜区外侧上皮细胞。RNA干扰后,Pm-PNU7在外套膜边缘区和套膜区的表达量均显著下调,贝壳棱柱层和珍珠层微观结构均出现不同程度的紊乱。【结论】Pm-PNU7参与了贝壳棱柱层和珍珠层的形成。     

马氏珠母贝PmLec-8基因的克隆与表达分析

Lec-8(C-type lectin 8)属于C-型凝集素超家族,在机体抵抗微生物的感染过程起重要的作用。本研究采用RACE技术克隆出了PmLec-8基因cDNA全长序列,并且运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测了PmLec-8基因在马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)不同组织中的表达模式。结果显示:PmLec-8基因序列全长737 bp,其中5′UTR长为36 bp,3′UTR长为113 bp,开放阅读框(ORF)为588 bp,编码195个氨基酸,预测其分子质量约为22.90 ku,等电点为5.17;PmLec-8具在一个糖类识别结构域(Carbonhydrate-recognition domain,CRD),符合典型的C型凝集素(C-type lectin)家族特征;多序列比对结果表明物种间Lec-8的同源性较低,4个半胱氨基酸残基高度保守;qRT-PCR数据分析表明,PmLec-8在马氏珠母贝肝胰腺、性腺、闭壳肌、鳃、血细胞和外套膜中均有表达,其中肝胰腺中表达量最高,其次是鳃,差异具统计学意义(P0.05)。     

企鹅珍珠贝Sox9基因的克隆及表达分析

【目的】更好地了解企鹅珍珠贝性别转换机制。【方法】RACE-PCR技术克隆企鹅珍珠贝Sox9基因cDNA的全长序列,分析其理化性质和进化地位;荧光定量PCR技术分析Sox9基因在各组织及不同时期性腺中的表达特征。【结果与结论】Sox9基因cDNA序列全长2 267 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 410 bp,编码469个氨基酸。氨基酸序列比对显示企鹅珍珠贝Sox9基因与黑蝶真珠蛤(Pinctada margaritifera)和马氏珠母贝(Pinctada fucata)有高度同源性(81%)。Sox9在企鹅珍珠贝各组织中均有表达,在足中表达量最高(P0.05),精巢中其次;Sox9在成熟期精巢检测到最大表达量(P0.05),在发育早期精巢、退化期精巢和成熟期卵巢中表达量较低,其中发育早期卵巢表达量最低(P0.05)。     

马氏珠母贝DNA甲基化转移酶Dnmt1的克隆及表达

【目的】对马氏珠母贝(Pinctada martensii)DNA甲基化转移酶1(DNA methyltransferase 1,Dnmt1)的基因全长及组织表达作分析,探究马氏珠母贝甲基转移酶Dnmt1(PmDnmt1)参与贝壳矿化调控机理。【方法】利用RACE技术获得PmDnmt1的c DNA序列全长,并对PmDnmt1的序列特征进行分析,同时利用逆转录-聚合酶链反应RT-PCR技术检测马氏珠母贝不同组织中PmDnmt1的表达情况。【结果与结论】PmDnmt1基因c DNA长4 818 bp,其中,开放阅读框为4 623 bp,编码1 540个氨基酸。预测分子质量约为174.55 ku、理论等电点为5.89。结构域分析显示,PmDnmt1具有DMAP结合结构域、DNMT1-RFD结构域、锌指结构、BAH结构域和C5胞嘧啶DNA甲基化酶结构域等。多序列比对结果发现,Dnmt1在不同物种间具有较高保守性。实时荧光定量PCR分析显示PmDnmt1在所有检测组织中均有表达,在外套膜中央膜部分的表达量最高(P 0.05)。PmDnmt1可通过调控外套膜的DNA甲基化修饰参与贝壳的形成。     

温度、盐度对马氏珠母贝外套膜Hsp70基因表达量的联合影响

设定温度范围16～40°C,盐度范围10～50,采用复合设计和响应曲面分析法在实验室条件下研究不同温度、盐度对马氏珠母贝(P.fucata)外套膜Hsp70基因表达量的综合效应并建立模型。采用方差分析(ANOVA)、决定系数等对实验所得回归方程模型进行显著性及拟合度检验。结果表明,温度的一次、二次效应对马氏珠母贝外套膜Hsp70基因表达量影响显著(p值<0.05);盐度的一次效应对马氏珠母贝外套膜Hsp70基因表达量无显著影响(p值>0.05),二次效应对马氏珠母贝外套膜Hsp70基因表达量影响极显著(p值<0.05);温度、盐度之间的互作效应对马氏珠母贝外套膜Hsp70基因表达量无显著影响(p值>0.05)且温度的效应大于盐度的效应。经响应曲面分析法和优化,得到马氏珠母贝外套膜Hsp70基因表达量在适宜的温度、盐度范围内呈峰值变化,在温度26.85°C、盐度29.39时,马氏珠母贝外套膜Hsp70基因表达量达到最小值0.95,满意度达到99.36%。建立了马氏珠母贝外套膜Hsp70基因表达量模型方程,其决定系数98.69%,矫正决定系数97.38%,预测决定系数91.42%,模型的拟合度极高,可用于预测马氏珠母贝外套膜Hsp70基因表达量。     

马氏珠母贝Su(H)基因克隆与组织特异性表达

Su(H)基因(Suppressor of Hairless gene)对生物体细胞的分化、增殖和凋亡起重要的调控作用。根据马氏珠母贝(Pinctada martensii)转录组数据库中注释为Su(H)的unigene序列设计基因特异性引物,应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得了马氏珠母贝Su(H)[pm-Su(H)]基因cDNA全长序列。结果表明:pm-Su(H)基因全长3 830 bp,其中开放阅读框含有1 920 bp,编码640个氨基酸残基,5'UTR为1 568bp,3'UTR为342 bp,含有27 bp polyA;预测其分子质量为70.6 ku,等电点为7.38;多序列比对显示,pm-Su(H)与其他物种的Su(H)有较高的保守性,与牡蛎(Crassostrea gigas)的同源序列高达80%;荧光定量PCR分析表明,pm-Su(H)在马氏珠母贝闭壳肌、鳃、珍珠囊、外套膜、肝胰脏、性腺、足、血淋巴等8组织中均有表达,其中以性腺中表达量最高,其次是珍珠囊和外套膜。     

马氏珠母贝载脂蛋白-2基因的克隆与表达分析

以RACE技术克隆获得马氏珠母贝载脂蛋白-2(Pm-ApoL2)基因cDNA全长序列,以传统萃取法提取黄色与白色闭壳肌个体的类胡萝卜素,以荧光定量技术检测Pm-ApoL2基因在各个组织中的表达量及黄与白闭壳肌个体的Pm-ApoL2表达量。结果表明,Pm-ApoL2基因cDNA序列全长1 328 bp,开放阅读框(ORF)长705 bp,编码234个氨基酸,5′非翻译区(5′UTR)长342 bp,3′UTR长281 bp。Pm-ApoL2在肝胰腺中表达量最高,其后依次是外套膜、鳃、闭壳肌,其中肝胰脏表达量显著大于其它3个组织(P0.05)。黄、白色闭壳肌个体之间的类胡萝卜素含量和Pm-ApoL2的表达量都存在显著性差异(P0.05),且二者的类胡萝卜素含量与Pm-ApoL2表达量呈显著正相关。Pm-ApoL2基因为马氏珠母贝类胡萝卜素代谢候选基因。     

脂多糖刺激对马氏珠母贝血细胞DNA甲基化修饰的影响

【目的】研究马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)血细胞基因组DNA的甲基化修饰情况及其在脂多糖(LPS)刺激后的变化,为探究甲基化修饰在珍珠贝免疫防御中的作用提供理论基础。【方法】运用甲基化敏感扩增多态性法(MSAP)分析马氏珠母贝血细胞(正常养殖贝)以及注射LPS后(6、12、24 h)基因组CCGG位点甲基化的修饰水平变化,并对甲基化修饰位点进行回收测序。【结果】共获得1 102个清晰可辨的DNA条带,其中全甲基化位点条带215个,半甲基化位点条带127个,非甲基化位点条带760个。对照组血细胞基因组CCGG位点的甲基化修饰比例为23.76%,注射LPS后,甲基化比例为28.10%～48.25%,注射6 h时最低,12 h时最高;对特异性片段测序后,经Blast比对,得到5条存在甲基化修饰的基因序列,其中2条具有注释信息,分别是干扰素调控因子(Interferon regulatory factor)和磷脂酶BL2(Putative phospholipase B-like 2)。【结论】马氏珠母贝血细胞基因组CCGG位点的甲基化修饰参与调控LPS诱导的免疫反应,在免疫防御中发挥重要作用。     

马氏珠母贝热休克蛋白HSP60基因的克隆与表达分析

运用cDNA末端快速扩增（RACE）技术,克隆马氏珠母贝（Pinctadamαrtensii）热休克蛋白HSP60基因 cDNA全序列。序列全长2495坤,开放阅读框（ORF） 1734坤,编码577个氨基酸,预测的分子量约为61.79阳, 理论等电点为5.4905＇非翻译区（ 5＇UTR）长150坤, 3＇非翻译区（3＇UTR）长611 bp。同源性比对分析结果,马 氏珠母贝HSP60基因与与太平洋长牡妨（Crωsos仰a gIgω）和光滑双蹄螺（Biomphalaria glabrata）的同源性较 高,达到75%。氨基酸序列分析显示,马氏珠母贝HSP60氨基酸序列具有典型的rnt-HSP60特征序列、C-末端典型的GGM重复基序和一个ATP结合结构域。荧光定量数据分析发现,该基因在闭壳肌、外套腹、血淋巴、肝膜腺、性腺、躁、等6个组织中具有表达,在肝膜腺中表达量最高,腮中次之,而在血液和闭壳肌中仅有少量表达;在脂多糖剌激后,该基因表达水平上调,12 h后达到最大值,之后又逐渐下调,均高于对照组,差异具统计学意 义（P〈0.05）。     

转录因子CREB对合浦珠母贝无定型碳酸钙结合蛋白启动子的调节作用

【目的】研究无定型碳酸钙结合蛋白(ACCBP)基因的上游调控机制。【方法】以合浦珠母贝(Pinctada fucata)为研究对象,利用基因组步移技术克隆合浦珠母贝ACCBP基因(PfACCBP)的启动子。设计启动子截短实验,通过双荧光素酶标记法确定启动子与转录因子CREB的结合位点,定位启动子中的功能元件。克隆转录因子环腺苷效应元件结合蛋白(CREB),并通过共转染实验和凝胶迁移率分析检测启动子的相对转录活性。【结果】获得合浦珠母贝ACCBP基因的启动子序列,ACCBP启动子在HEK-293T细胞系中转录活性较高;该启动子上存在CRE元件,该元件可在转录过程中与CREB蛋白直接结合,大幅上调ACCBP启动子的转录效率。【结论】转录因子CREB可通过与ACCBP启动子上的CRE元件结合而增强转录活性的调控作用。     

4种壳色马氏珠母贝遗传规律研究

以黑、白、红、黄4种壳色马氏珠母贝选育系F6代为亲本,选取4种壳色最纯的雌雄个体各1个,采用解剖授精法和双列杂交的方法繁育子代,建立了6个杂交组合,包括4个自交组及12个正反交组。结果表明,马氏珠母贝壳色由背景色基因和前景色基因共同表达而成,位于不同的基因位点上;经过连续7代选育的4种壳色纯化度较高,壳色可以稳定遗传给下一代,其遗传规律比较复杂。黄色和白色为马氏珠母贝的背景色,白壳色贝存在母系遗传,若为隐性纯合含致死基因,黄色相对白色为显性;黑色和红色为马氏珠母贝前景色,相对无前景色为显性,黑色与红色共显。