香鱼(Plecoglossus altivelis)致病性类志贺邻单胞菌的分离与生化药敏鉴定

香鱼(Plecoglossus altivelis)是名贵洄游性鱼类,由于高密度养殖等因素导致病害频发。2021年7月强台风"烟花"过境后浙江省宁海县养殖香鱼暴发体表溃烂病,死亡严重。病鱼皮肤、肌肉溃烂并伴有周围皮肤充血。组织切片观察显示病鱼患处肌纤维断裂,周围红细胞、炎性细胞浸润;鳃丝和鳃小片中红细胞增多;肝细胞核呈空泡,部分细胞核染色质边集;脾脏内红细胞数量减少,部分白细胞聚集;肠黏膜上皮细胞脱落。从患病香鱼肠中分离到一株菌(编号NH21),其菌落低突、边缘光滑表面湿润,该菌株为革兰氏阴性菌,菌体呈短杆状、端圆。经生化特性和16S rDNA序列分析鉴定NH21菌株为类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)。用该菌株对健康香鱼进行回归感染后,人工感染香鱼呈现与本次体表溃烂病香鱼相似的症状,经计算NH21菌株对香鱼的半致死剂量(LD₅₀)为2.51×10⁷ CFU/mL。25种抗生素的药敏试验显示NH21菌株对阿奇霉素、头孢氨苄、新生霉素、多黏菌素B、头孢西丁、呋喃唑酮6种抗生素敏感。从NH21菌株中检出了毒力基因9个、耐药基因8个。综合分析表明,分离得到的类志贺邻单胞菌NH21菌株是本次宁海县香鱼体表溃烂病的病原菌,研究结果为香鱼出现类似病症的预防和治疗提供了基础资料。     

青鱼(Mylopharyngodon piceus)新发病病原类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)的分离鉴定

为研究青鱼暴发性死亡原因,从病症典型青鱼(Mylopharyngodon piceus)肌肉、肝脏和肾脏处进行细菌接种,分离获得一株细菌(HZ2015),对其进行了形态观察、生化特性检测和16S r RNA序列分析,通过动物回归实验、毒力检测和药敏试验了解其对青鱼的致病性、毒力及药物敏感性。所得菌株为类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides),动物回归实验能复制出类似症状,且能从体内再次分离到该菌株;分离株对小鼠的半数致死量(LD50)为106.6 CFU;对头孢呋辛、头孢哌酮、庆大霉素、卡那霉素、复达欣高度敏感。研究表明,菌株HZ2015为青鱼体表溃烂病病原,本研究系类志贺邻单胞菌致青鱼体表溃烂病的首次报道。     

小黄鱼(Larimichthys polyactis)鰤鱼诺卡氏菌的分离及鉴定

为探明舟山海域网箱养殖小黄鱼(Larimichthys polyactis)暴发的以体表溃疡、眼球溃烂、内脏出现白色结节为主要症状的疾病病因, 对患病小黄鱼体表溃疡处和结节病灶处采集组织样本, 在血琼脂平板上划线培养, 通过分离、纯化到同一优势菌株ZHNK2101。经形态学观察、生理生化鉴定、16S rRNA基因片段扩增及序列比对,确定该菌株为鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)。药敏试验结果显示, 菌株ZHNK2101对哌拉西林、头孢曲松、丁胺卡那、庆大霉素等16种抗生素敏感。回归感染试验表明, 该菌株可以感染小黄鱼并引起和自然感染相同的症状, 半致死浓度LD₅₀为7.28×10⁴ CFU/尾。另外,该病株会引起小黄鱼鳃、肝、肾和脾脏发生病理变化, 主要表现为鳃丝紊乱,肝脏、肾脏、脾脏组织细胞纤维化形成病理性结节。试验首次报道了小黄鱼感染鰤鱼诺卡氏菌的病例, 并从理化特性、药敏试验、回归感染及组织病理变化等方面对该菌株的特性进行了初步研究, 为小黄鱼养殖过程中由鰤鱼诺卡氏菌引起的内脏白点病的早期预防和治疗提供基础数据。     

斑点叉尾鮰(Ictalunes punctatus)源中间气单胞菌(Aeromonas media)分离鉴定及药敏特性

从湖南常德某养殖场死亡的斑点叉尾（Ictalunes punctatus）肝脏、肾脏、腹水及血水中分离到一株致病性菌株zy02。对该菌进行了形态特征观察、理化特性测定及分子生物学方法鉴定,用PCR方法同时扩增其16S rDNA和gyrB基因,分析了16S rDNA和gyrB两种基因序列的同源性,并构建了系统发生树。经生理生化测定和16S rDNA与gyrB基因序列分析,zy02株为中间气单胞菌。人工感染该菌后发病鱼表现为与自然发病类似症状,且从组织中再分离的细菌特性与原感染菌相同。腹腔注射后该菌株对斑点叉尾的半致死浓度为3.89×10⁶CFU/mL。菌株zy02对多西环素、庆大霉素及左氧氟沙星等高度敏感;对红霉素中度敏感;对阿莫西林、磺胺异噁唑、克林霉素及利福平等5种药物耐药。本研究为斑点叉尾该病防控提供了理论依据。     

太平洋双色鳗鲡(Anguilla bicolor pacifica)致病性类志贺邻单胞菌的鉴定和中药敏感性研究

从发病死亡的养殖太平洋双色鳗鲡(Anguilla bicolor pacifica)肝脏中分离到一株优势菌AMSH1,为研究其种属、毒力及中药敏感性,结合BIOLOG微生物鉴定系统和16S r DNA序列分析对该菌株进行鉴定,并通过人工回归感染试验确定其致病性。此外,还研究了10味中药单用、10种双联用和4种三联用对该菌株的体外抑菌作用。结果显示该菌株为类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)。经人工腹腔注射感染健康太平洋双色鳗鲡,证实该菌具有致病性,半致死量LD50为3.2×105CFU/g。药敏试验结果表明,10味中药均有较好的抑菌效果,其中五倍子(Galla chinensis)、丁香(Eugenia caryophllata)和生地榆(Sanguisorba officinalis)的效果最好,7种双联用复方和1种三联用复方均具有协同抑菌作用。本次引起太平洋双色鳗鲡发病的病原为类志贺邻单胞菌,该菌对太平洋双色鳗鲡的致病性及其中药药敏的研究属首次报道。建议选用含五倍子的中药双联用复方或三联用复方进行防治,皆绿色环保。     

大口黑鲈(Micropterus salmoides)致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及其特性分析

大口黑鲈(Micropterus salmoides)是我国重要的淡水养殖经济鱼类品种,目前包括细菌性疾病在内的诸多因素影响了其养殖业的健康发展。维氏气单胞菌是引起淡水鱼败血症和溃疡综合征的重要病原菌。从患病大口黑鲈肝脏组织中分离到1株病原菌,通过形态学观察、生理生化特性分析、16S rRNA序列和特定毒力基因分析对其进行鉴定,并通过人工回归感染试验和药敏试验分析其致病性和耐药性。结果表明该菌为致病性维氏气单胞菌(Aeromonas veronii),含有aer、act、lip、fla、gcaT和OMPA I等毒力基因;药敏试验显示其对头孢曲松、氯霉素、氟苯尼考、强力霉素、四环素、多粘菌素、复方新诺明、左氟沙星等8种抗生素高度敏感,对新霉素、恩诺沙星、庆大霉素、链霉素、阿齐霉素、环丙沙星等6种抗生素中度敏感,对其他8种抗生素具有一定耐药性;人工回归感染实验表明该菌具有较高的致病性,对大口黑鲈的半致死浓度为1.4×10⁶ CFU/mL。维氏气单胞菌是水产养殖中的条件性致病菌,研究结果揭示了该菌株的部分生物学特性,有利于丰富维氏气单胞菌属的基础数据,同时也为鲈鱼养殖过程中的病害防控提供了一定的参考依据。     

一株大口黑鲈源ST-873型肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的分离鉴定及生物学特性研究

从患腹水病大口黑鲈(Micropterus salmoides)的头肾、脾脏、肝脏组织中分离到一株优势菌,生长出圆形、边缘整齐的灰白色黏液状菌落;染色镜检可见短粗、卵圆形、有荚膜的革兰氏阴性杆菌。结合形态、生理生化特征、16S rRNA基因序列分析鉴定为肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae),MLST分析进一步确定其为ST-873型,与ST-65型聚为一支;该菌株携带aere、alls、wca和ybt四种毒力基因,具有溶血活性;人工感染大口黑鲈,发现患病鱼呈现腹水等与自然发病类似的症状,且病鱼内脏的分离菌株与攻毒菌株相同;经统计,其LD50为3.4×10⁷ CFU/mL,具有中等生物被膜形成能力。耐药性分析结果显示,该菌株携带bla-shv、sul2、aadA和tetB四种耐药基因,对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、黏菌素类药物敏感,对四环素类、磺胺类、林可酰胺类、利福霉素类耐药;中药三七、款冬花对分离菌株有明显抑制作用。研究探明了大口黑鲈腹水病的主要病原,可为鱼源肺炎克雷伯菌的诊断和防治提供科学依据和数据参考。     

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)致病性豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)的分离鉴定及其特性分析

近年来细菌性疾病因病原菌种类繁多、覆盖区域广而影响了其养殖业的健康发展,造成较大的经济损失。从体表具有黑斑、肢体残损症状的罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)肝胰腺组织中分离得到1株病原菌,通过形态学观察、生理生化特性鉴定、16S rRNA序列和特定毒力基因检测鉴定,以及人工回归感染试验和药敏试验分析其致病性和耐药性。结果表明,该菌为豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae),含有aer、lip、gcat、ser和OMPA I等毒力基因;药敏试验显示其对头孢曲松、氯霉素等7种抗生素高度敏感,对恩诺沙星、阿米卡星及复方新诺明3种抗生素中度敏感,对四环素、环丙沙星等10种抗生素具有耐药性;人工回归感染实验表明该菌具有较高的致病性,对罗氏沼虾的半致死浓度为6.54×10⁵ CFU/mL。豚鼠气单胞菌作为水产养殖中的条件性致病菌,研究结果揭示了该菌株的部分生物学特性,有利于丰富豚鼠气单胞菌属的基础数据,同时也为罗氏沼虾养殖过程中的病害防控提供了一定参考依据。     

养殖黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco) 鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)的分离鉴定与生物学特性研究

从四川眉山与新津两地患红头病的养殖黄颡鱼体内分离到2株优势菌(CHNYC001与CHNYC002),以腹腔注射与浸泡的方式进行人工感染试验,证实其为养殖黄颡鱼红头病的病原菌。根据分离菌株的形态、生理生化特性,结合16SrDNA序列测定(GenBank登录号分别为FJ766524、FJ766525)与系统发育分析,将其鉴定为鮰爱德华氏菌(Edwardsie lla ictaluri)。分离菌株最适生长温度为20—30℃,最适生长pH为7.0,在含盐量2%以上的培养基上不生长,对氟苯尼考、强力霉素、洛美沙星等敏感,对乙酰螺旋霉素、磺胺甲基异噁唑和麦迪霉素等不敏感。临床病理特征分析发现,养殖黄颡鱼感染爱德华氏菌临床上分为急性与慢性两种类型,急性型主要表现为败血症的病变特征,慢性型表现为头顶出血,发红与溃疡的病变特征。     

养殖浅色黄姑鱼体表溃烂症病原菌的分离与鉴定

浅色黄姑鱼的高密度养殖一直受到病害的困扰,导致成鱼养殖成活率低,直接影响了浅色黄姑鱼养殖业的发展.以汕头南澳岛患皮肤溃烂症的养殖浅色黄姑鱼为材料,从其溃烂头部组织中分离得到优势菌KLg,人工感染实验证实菌株KLg为浅色黄姑鱼的致病菌.药敏试验表明菌株KLg对头孢哌酮、红霉素、头孢曲松、先锋霉素V、复达欣、头孢呋辛和氧哌嗪青霉素等7种抗生素敏感,革兰氏染色、生理生化测定等手段初步确定菌株KLg为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi),这一结果通过16S rDNA基因序列及进化树分析得到进一步确认.哈维氏弧菌是海水养殖鱼类的常见致病菌,但在浅色黄姑鱼养殖中尚属首次报道.实验结果可为我国沿海地区浅色黄姑鱼养殖中弧菌病害的防治提供重要参考.     

一株大口黑鲈(Micropterus salmoides)虹彩病毒(Iridoviridae)的分离及鉴定

2018年7月,浙江省某大口黑鲈(Micropterus salmoides)养殖场暴发疑似病毒引起的疾病。现场采样发现,病鱼体长约15—20cm,鱼体于水面下暗游,反应迟钝,体表有出血点或溃疡症状。本研究通过采用鲤鱼上皮瘤细胞(epithelioma papulosum cyprinid, EPC)培养、超薄切片透射电镜观察、病毒主要衣壳蛋白(majorcapsidprotein,MCP)克隆与测序分析等方法,从患病大口黑鲈中分离得到一株病毒,鉴定其属于虹彩病毒科蛙病毒属,命名为大口黑鲈虹彩病毒宁波分离株(LMBIV-NB001)。EPC经患病鱼组织匀浆液接种后出现细胞圆缩、死亡、脱落等典型的细胞病变症状。将感染后的EPC细胞制作超薄切片,通过电镜观察发现,EPC细胞质中存在大量直径约120nm具囊膜的正六边形成熟病毒粒子,形态与虹彩病毒相似。根据虹彩病毒MCP基因保守区域序列设计特异性引物对病鱼组织样本进行PCR扩增,获得了1029bp的目的基因片段。将该扩增片段连入pMD19-T simple质粒后测序,经BLAST比对分析显示,其与GenBank中已报道的鳜鱼蛙病毒NH-1609、大口黑鲈溃疡综合征病毒BG/TH/CU3、EPC060608-08的MCP基因同源性最高,相似度均达到99.13%。构建系统进化树分析表明,本研究分离的LMBIV-NB001株与NC_038508、GU256635、MG941005等虹彩病毒科蛙病毒属毒株聚成一簇。本论文研究结果为不同地区蛙病毒属成员的起源和分化等相关研究等提供了基础材料。     

牙鲆鳃淋巴样组织内免疫相关细胞的超微结构

利用电镜技术观察海水鱼类牙鲆鳃小片的基本结构及其免疫相关细胞的分布和形态。牙鲆的鳃小片主要由扁平上皮细胞和柱细胞构成 ,血窦腔极为发达。鳃小片在功能上可分为两个区 :气体交换区和免疫区。气体交换区位于上半部分 ,血窦内主要分布着红细胞 ;免疫区位于鳃小片基部 ,血窦腔中分布着各种免疫相关细胞 :淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和酸性粒细胞。此外 ,还观察到了泌氯细胞和粘液细胞。研究结果证明 ,牙鲆的鳃在局部粘膜免疫中具有重要的作用 ,是鱼类免疫体系中的有机组成成分之一     

基于16S rRNA和recA香鱼鳗利斯顿氏菌的分离鉴定

为研究引起香鱼(Plecoglossus altivelis)出血溃烂症病因及致病菌系统发育地位,本研究从患病香鱼的肝脏、肾脏及体表分离到11株病原菌(编号:X0901-X0911),运用常规细菌生理生化方法鉴定致病菌所属种类;运用16SrRNA基因、recA基因序列分析方法研究致病菌的系统发育地位。细菌生理生化鉴定结果表明:致病菌为鳗利斯顿氏菌,11株细菌生理生化结果相同,均为革兰氏阴性杆菌、氧化酶阳性、接触酶阳性、吲哚阳性、精氨酸脱羧酶阳性、精氨酸双水解酶阳性、硝酸盐还原阳性、甘露醇阳性、MR测定阳性;H2S阴性、V-P测定阴性等。根据16SrRNA基因、recA基因序列分别构建弧菌科常见细菌系统进化树,结果表明:致病菌与鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)均聚为一枝,聚类结果与细菌生理生化鉴定结果相符。致病菌与鳗利斯顿氏菌16SrRNA基因、recA基因的同源性分别为99.9%、99.8%。以recA基因构建的系统进化树的拓扑学结构与16SrRNA基因建树结果相类似。此外,与16SrRNA基因相比,recA基因在不同物种之间具有更高的鉴别能力,本研究表明recA基因适合作为弧菌科常见细菌物种间进化关系研究的标记。     

养殖大菱鲆细菌性红体病病原菌的分离与鉴定

从患有红体病的养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus)的肌肉中分离得到一株优势菌并记为H1.经人工注射感染证实H1即为引起养殖大菱鲆红体病的病原菌,其半致死量LD50为2.82×105CFU/mL,而低浓度(1.41×103 CFU/mL)没有造成死亡,但注射部位有脓肿现象,注射相同体积1.5%无菌生理盐水的对照组没有明显的症状,注射部位也无异常.革兰氏染色显示该菌为革兰氏阴性,菌体呈杆状,周生鞭毛.综合该菌的形态、常规生理生化特征和API32E鉴定结果,发现H1与迟钝爱德华氏菌的表性特征非常相似,相似率迭到99.9%.在分子水平上对其16SRNA基因序列的测定,同源性分析,结果表明H1与迟钝爱德华氏菌的亲缘关系最近,相似度达到99%.综合上述研究结果,将该菌株初步鉴定为迟钝爱德华氏茵(Edwardsiella tarda).     

斑点叉尾(Ictalunes punctatus)源鲁氏耶尔森氏菌的分离鉴定及系统发育分析

从发病的斑点叉尾肝脏和肾脏均分离到一高致病性的菌株(FF003),感染该菌后斑点叉尾表现为体表多处点状出血,特别是在下颌、腹壁、体侧处,各内脏器官不同程度出血,尤其是腹内膜和鳔内膜斑块状出血。该菌为非发酵型需氧,革兰氏阴性杆菌,对除麦芽糖、甘露糖、果糖、海藻糖、D-甘露醇以外的多种糖类不利用产酸,氧化酶阴性,精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶阳性,MR阳性。在以该菌16S rDNA序列(GenBank登录号为FJ908709)和GenBank数据库内同源性较高的细菌16SrDNA序列构建的系统发育树中,分离菌FF003株与鲁氏耶尔森氏菌(Yersinia ruckeri)聚为一个分支,结合形态和生理生化特点将其鉴定为鲁氏耶尔森氏菌。药敏实验结果表明氟哌酸、环丙沙星、强力霉素、氯霉素对其高度敏感,头孢拉定、克拉霉素、磺胺甲基异唑、庆大霉素、麦迪霉素等药物不敏感。     

美国红鱼肾肿大症的组织病理和超微病理分析

采用组织学方法,获得患肾肿大症美国红鱼的心、脾、肾、肝、肠和鳃6种组织,利用组织切片以及超薄切片电镜技术对患病组织的病理变化进行了研究分析,探讨该病的致病机制。患病红鱼解剖后主要症状为:体表溃烂,部分病鱼鳍条上有肿块;病鱼肾脏显著肿大,体积甚至达到正常肾脏的1()倍;肝脏、脾脏及胆囊等也有肿大现象;有些病鱼脏器上有白色结节。组织病理显示:美国红鱼肾肿大症的主要表现为肾脏有典型的肉芽肿,大量炎性细胞浸润,肾小管管壁破裂、坏死;肝脏中肝实质有充血现象,实质细胞呈空泡变性;脾脏充血,现大量病变的红细胞,有脂肪样变。超徽病理显示:肾近曲小管上皮细胞凋亡现象严重,肾小管内刷状缘排列稀疏;肝细胞坏死严重,肝细胞界限模糊不清;脾脏组织脾窦扩张,有大量凋亡红细胞和淋巴细胞。实验结果表明:美国红鱼肾肿大症的组织细胞结构发生明显的病理变化,肾脏和肝脏等主要组织器官受到严重损伤病变,使鱼体不能进行正常的生命活动,最后导致死亡。     

养殖鲟鱼出血症病原鲁氏耶尔森菌的分离鉴定和致病性研究

鲁氏耶尔森菌(Yersinia ruckeri)是鲑鳟鱼类和温水性鱼类肠炎红嘴病的主要病原,可引起病鱼体表出血、肠道肿胀发炎等临床症状。本研究从患出血症施氏鲟(Acipenser schrenckii)中分离到一株致病性菌株(YR-H01),生理生化鉴定和16S rRNA基因序列分析表明YR-H01株为鲁氏耶尔森菌。人工感染该菌后发病鱼表现为肛门红肿、外突明显,部分鱼鳍基部和下颌处有出血现象,内脏器官不同程度出血,且从组织中再分离的细菌特性与原感染菌相同。腹腔注射后该菌株对施氏鲟的半致死浓度为7.2×106CFU,且攻毒剂量越大,临床病症出现越快。病理组织切片显示,该菌感染鲟鱼后肝细胞发生明显病变,淋巴细胞侵润,肝索结构消失,细胞肿胀,核空泡变性或核仁边缘化。