拟穴青蟹(Scylla paramamosain)蛋白二硫键异构酶基因的分子克隆与表达分析

蛋白二硫键异构酶(PDI)是内质网中的关键酶, 参与蛋白合成过程中二硫键的形成、还原和异构。本文首次从拟穴青蟹(Scylla paramamosain)克隆获得了PDI基因cDNA全长, 该序列长度为2015bp, 开放阅读框为1452bp, 编码483个氨基酸。荧光定量PCR检测发现PDI存在于拟穴青蟹的多个组织中; 在拟穴青蟹卵巢发育过程中, PDI基因的表达量在前4个时期逐渐上升, 到了第5期(成熟期)表达量则下降, 表明PDI参与了卵巢发育的蛋白合成过程。免疫组化表明, 拟穴青蟹卵母细胞存在PDI阳性反应, 进一步为该分子参与卵巢发育提供了形态学证据。     

拟穴青蟹DDX5基因的表达及功能初步分析

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是我国东南沿海重要的经济养殖蟹类之一。DDX5基因是DEAD-box解旋酶基因家族中的成员,已有研究表明其在生殖细胞的成熟分化及功能维持中起重要的调控作用。我们从拟穴青蟹转录组数据库中筛选获得了DDX5(SpDDX5)基因序列,采用实时荧光定量PCR技术分析了其在成熟青蟹各组织、性腺各发育时期及胚胎各发育时期的表达模式。此外,利用RNAi技术分析了SpDDX5在性腺发育中可能发挥的作用。结果如下：SpDDX5的开放阅读框长1 893 bp,编码630个氨基酸,具有DEXDc和HELICc两个结构域。SpDDX5在拟穴青蟹的各组织中广泛表达,且在精巢中的表达水平明显高于其他组织(P<0.05);在精巢发育过程中,SpDDX5的表达水平逐渐降低;在胚胎发育过程中,SpDDX5的表达水平逐渐升高。干扰SpDDX5后,生殖细胞分子标记基因Vasa和Nanos表达上调,性腺发育相关基因foxl-2表达下调,Dmrt家族基因Dsx表达上调,Dmrt-like和idmrt-2表达下调。根据以上结果,我们推测SpDDX5基因可能在拟穴青蟹生殖细胞...     

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)两种Ⅰ型高血糖激素基因全长cDNA的克隆及组织表达分析

采用RT-PCR及RACE技术,从拟穴青蟹眼柄组织中克隆了两种Ⅰ型高血糖激素CHH基因(分别命名为C1与C2)cDNA全序列。序列分析结果表明:C1基因全长1859bp,开放阅读框长420bp,编码139个氨基酸,分子量为15.326kDa,等电点为5.540;C2基因全长1739bp,开放阅读框长426bp,编码141个氨基酸,分子量为15.621kDa,等电点为7.618。与其它物种CHH氨基酸序列进行同源性比较分析显示,拟穴青蟹CHH基因与榄绿青蟹CHH基因同源性最高(92%),依次为日本鲟(80%)、三疣梭子蟹(78%)。聚类分析表明,拟穴青蟹CHH氨基酸序列与榄绿青蟹和日本鲟紧密聚为一支。经荧光定量检测,拟穴青蟹CHH基因在眼柄、肝胰腺、心脏、肠中表达量较高,鳃、胃中表达量很少,肌肉中表达极少。盐度骤变试验结果表明:盐度胁迫24h后,C2的表达量是C1的30倍以上;C2基因盐度5时与对照组的表达量差异不显著(P>0.05),盐度15时差异显著(P<0.05),盐度22、25、30时差异极显著(P<0.01);盐度变化越大,C2的表达量越大。上述结果为进一步深入研究CHH基因的功能及调控机理奠定基础。     

CLONINGAND EXPRESSION OF TWO GENES ENCODING TYPE I CRUSTACEAN HYPERGLYCEMIC HORMONE FAMILY FROM THE MUD CRAB SCYLLA

采用RT-PCR及RACE技术,从拟穴青蟹眼柄组织中克隆了两种I型高血糖激素CHH基因（分别命名为C1与C2）cDNA全序列。序列分析结果表明：Cl基因全长1859bp,开放阅读框长420bp,编码139个氨基酸,分子量为15．326kDa,等电点为5．540;C2基因全长1739bp,开放阅读框长426bp,编码141个氨基酸,分子量为15．621kDa,等电点为7．618。与其它物种CHH氨基酸序列进行同源性比较分析显示,拟穴青蟹CHH基因与榄绿青蟹CHH基因同源性最高（92％）,依次为日本鲟（80％）、三疣梭子蟹（78％）。聚类分析表明,拟穴青蟹CHH氨基酸序列与榄绿青蟹和日本鲟紧密聚为一支。经荧光定量检测,拟穴青蟹CHH基因在眼柄、肝胰腺、心脏、肠中表达量较高,鳃、胃中表达量很少,肌肉中表达极少。盐度骤变试验结果表明：盐度胁迫24h后,c2的表达量是C1的30倍以上;C2基因盐度5时与对照组的表达量差异不显著（P〉0．05）,盐度15时差异显著（P〈0．05）,盐度22、25、30时差异极显著（P〈0．01）;盐度变化越大,C2的表达量越大。上述结果为进一步深入研究CHH基因的功能及调控机理奠定基础。     

三疣梭子蟹细胞周期蛋白H基因克隆及其在卵巢发育中的表达分析

Cyclin H作为细胞周期调控活动中的关键因子,通过与相应的细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdks)结合来调控细胞周期中的各个环节,而三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)卵巢发育过程中存在旺盛细胞分裂活动的阶段,关于其卵巢发育的分子机制研究依旧较少。本实验通过SMART RACE方法,获得三疣梭子蟹cyclin H基因cDNA序列全长。并通过实时荧光定量PCR对其进行三疣梭子蟹卵巢发育相关的表达分析。结果发现,基因全长1 077bp,开放阅读框(ORF)、5’及3’非编码区(UTR)长度分别为999、31和46bp。预测编码一个包含332个氨基酸,分子量、等电点分别为38.89和6.20kDa的蛋白质,蛋白序列包含一个周期蛋白盒保守结构域。同源分析表明,三疣梭子蟹Cyclin H蛋白序列其他甲壳动物有着较高的同源性,与拟穴青蟹(Scylla paramamosain)和斑节对虾(Penaeus monodon)的同源性分别为95%和80%。表达分析后结果显示,cyclin H基因在卵巢中的表达量最高且在Ⅰ期和Ⅱ期卵巢中的表达量显著高于其他卵巢发育时期,去眼柄后该基因在卵巢中的表达量于第4天达到最大值且显著高于对照组,呈现先升高后降低的趋势(P0.05)。研究结果为深入开展三疣梭子蟹和其他甲壳动物性腺发育调控研究提供了重要信息。     

企鹅珍珠贝Dmrt2基因的克隆及表达分析

本研究利用RACE-PCR技术获得企鹅珍珠贝(Pteria penguin)一个Dmrt2基因cDNA的全长序列,通过荧光定量PCR分析Dmrt2基因在各组织中的表达特征,以及在早期卵巢、成熟期卵巢、早期精巢、成熟期精巢和排放期精巢中的表达变化。结果表明,Dmrt2基因全长1 257bp,其中开放阅读框(open reading frame,ORF)为951 bp,编码316个氨基酸,5′非编码区(untranslated region,UTR)为52 bp,3′UTR为254 bp,第20位到第73位氨基酸为DM结构域。预测其分子质量为36.61ku,等电点为9.80。氨基酸序列比对显示该企鹅珍珠贝Dmrt2基因与黑蝶真珠蛤(Pinctada margaritifera)和马氏珠母贝(Pinctada martensii)的Dmrt2基因同源性(identity)最高,分别为46.0%和45.7%。其中在DM结构域高度同源。荧光定量PCR分析组织表达特征显示,Dmrt2在企鹅珍珠贝的外套膜、鳃、消化盲囊、足、精巢和卵巢均有表达,其中在精巢中表达量最高(P0.05),足为其次,在闭壳肌中没有检测到Dmrt2表达。对性腺发育不同时期的表达量分析发现,Dmrt2在发育早期和成熟期卵巢中表达量都很低,在发育早期精巢中表达量较高,在成熟期精巢检测到最大表达量(P0.05),到精巢排放期表达显著下降,推测Dmrt2可能与企鹅珍珠贝精巢的发育有关,可能参与了企鹅珍珠贝雄性性别分化和性腺发育这一生理过程。     

拟穴青蟹卵巢早期发育的组织学观察

观察未交配拟穴青蟹(scylla paramamosain)卵巢的外部形态和组织学特征,计算性腺指数并确定其卵巢发育时期.结果发现:刚发生生殖蜕壳的拟穴青蟹,卵巢多数呈白浊状,处于发育前期(Ⅱ),个别颜色转黄已进入发育期(Ⅲ);暂养60d后,拟穴青蟹不论是否发生了生殖蜕壳,其卵巢均发育至将成熟期(Ⅳ)或成熟期(Ⅴ),有些个体性腺指数几乎与膏蟹相当,这表明未交配青蟹的卵巢也能发育成熟.     

脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)vasa基因cDNA克隆及其在卵巢发育中的表达分析

VASA蛋白属于DEAD-box家族蛋白,是一种RNA解旋酶,在生殖细胞的分化中具有重要作用。本研究从脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)卵巢中克隆得到vasa基因cDNA全长(将其命名为Ec-vasa),Ec-vasa序列长度为2516bp,开放阅读框(ORF)长度为1800bp,编码600个氨基酸,具有DEAD-box家族蛋白的8个高度保守的结构域,与日本沼虾(Macrobrachium nipponense)的同源性最高(80%)。半定量RT-PCR结果显示,Ec-vasa在卵巢组织中特异表达,在肌肉、肝胰腺、心脏和鳃等组织中均未检测到表达。荧光定量结果显示,Ec-vasa在卵巢发育Ⅰ期具有较高表达量,随着卵巢的发育,表达量逐渐降低,在第Ⅳ期达到最低水平。结果表明,Ec-vasa基因可能在脊尾白虾卵巢的早期分化和卵子发生过程中起重要作用。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)胞内氯离子通道蛋白基因克隆及其表达分析

本研究克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)胞内氯离子通道蛋白基因,命名为Pt CLIC。该基因c DNA全长2000bp,5’和3’非编码区(UTR)长分别为76bp和1162bp,开放阅读框长762bp,推测编码253个氨基酸,预测分子量为29.2k Da,理论等电点为5.93。生物信息学分析表明,Pt CLIC基因中未发现跨膜结构域,属于不稳定蛋白;同源性分析表明,Pt CLIC基因编码的氨基酸序列与蚤状溞(Daphnia pulex)CLIC基因的同源性高达83%;系统进化分析表明,三疣梭子蟹与拟穴青蟹首先聚为一支;实时荧光定量RT-PCR分析表明,Pt CLIC基因在选取的所有组织中均有表达,在肝胰腺中的相对表达量最高,且显著高于其它组织(P0.05)。低盐度胁迫显著改变了Pt CLIC基因在三疣梭子蟹鳃和肝胰腺中的表达模式,整体呈先上调后下调的趋势,并发现该基因在低盐耐受和低盐敏感家系中的表达规律差异显著。研究结果表明Pt CLIC基因在三疣梭子蟹渗透压调节中发挥重要作用,可辅助三疣梭子蟹耐低盐品系的选育。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)FABP基因克隆及其在卵巢发育过程中的表达特征研究

脂肪酸结合蛋白(fatty acid-binding protein,FABP)是胞内脂质结合蛋白超家族成员,在长链脂肪酸的摄取、转运及代谢调节中发挥重要作用。本研究采用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)脂肪酸结合蛋白基因(简称Pt FABP)c DNA全长,并采用实时荧光定量PCR技术测定了FABP基因在三疣梭子蟹不同组织和不同发育阶段卵巢中的表达情况,探讨了Pt FABP在卵巢发育过程中的作用。Pt FABP基因全长893bp,包括289bp的5’UTR,405bp的ORF和199bp的3’UTR。该基因编码长度为134个氨基酸的多肽,其理论p I为5.92,分子量为15.13k Da。Pt FABP氨基酸序列与中华绒螯蟹同源性最高(72%),且有一个Lipocalin结构域。q PCR的结果表明:FABP在三疣梭子蟹所有组织中均有表达,在卵巢中表达量最高,肝胰腺、眼柄中表达量中等,心脏、鳃、肌肉和血淋巴细胞中的表达较低。在卵巢发育过程中Pt FABP的表达量呈现先上升后下降的趋势,卵巢发育至近成熟期(Ⅳ期)时达到最高值,而在成熟排卵后不断降低。这与三疣梭子蟹卵巢发育伴随着脂类大量积累相关。因此上述研究结果表明,FABP可能参与调控三疣梭子蟹卵巢的发育,并且为后期胚胎的发育储存能量。     

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)微卫星位点开发—基于(AG)12探针杂交

采用FIASCO (Fast Isolation by AFLP Sequences Containing repeats)技术和磁珠富集方法开发拟穴青蟹微卫星位点.结果表明,400bp以下长度的序列含微卫星的概率超过400bp以上长度的序列;从二碱基重复类型到五碱基重复类型,完美型微卫星的概率在增加.利用设计的28对引物扩增一个供试群体,其中12对引物能稳定扩增且片段大小基本符合理论长度,10个微卫星位点表现出高度多态性,9个微卫星位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P＜0.05),两组两两位点间存在连锁不平衡现象(P＜0.0042,经Bonferroni法校正).Micro-Checker分析揭示其中的5个微卫星位点可能存在无效等位基因.排除混合微卫星位点的引物对以及扩增位点PIC值在0.5以下的引物对,8对引物能用于拟穴青蟹群体遗传学等研究.     

斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)两种催乳素受体基因的 cDNA 克隆和 mRNA 表达分析

采用RT-PCR方法克隆了斜带石斑鱼两种催乳素受体(Prolactin receptor,PRLR)的cDNA序列,序列分析表明:PRLR1开放阅读框为1947bp,共编码649个氨基酸,PRLR2开放阅读框为1749bp,共编码487个氨基酸,PRLR1与PRLR2的氨基酸同源性为40.4%。用Real-time RT-PCR方法研究了PRLR1和PRLR2在各组织和早期发育不同阶段的表达情况,结果表明:PRLR1和PRLR2在所检测的12种组织中均有表达,其中以鳃、肾、肠表达量较高;PRLR1在受精期表达最高,PRLR2在视囊形成期表达最高,而且除受精卵期外PRLR2在各时期的表达量均高于PRLR1。     

圆斑星鲽(Verasper variegatus)wtl基因的克隆与表达分析

圆斑星鲽（Verasper variegatus）雌鱼生长快,成熟雌鱼个体大小是雄鱼的2倍以上,开展性别相关基因的功能研究,对于探究圆斑星鲽性别决定机制,建立单性培育技术具有重要意义。本研究获得了wt1a及wt1b两个同源基因,wt1a基因全长为3263bp,预测开放阅读框（ORF）长为1245bp,编码415个氨基酸,5''-UTR和3''-UTR分别长372bp和1640bp;wt1b基因全长为2312bp,预测开放阅读框（ORF）长为1281bp,编码427个氨基酸,5''-UTR和3''-UTR分别长369bp和659bp。wt1a基因编码氨基酸分子量为46.2kDa,理论等电点为9.24,无跨膜结构及信号肽,在ORF末端有4个锌指结构,编码KTS三肽;wt1b基因编码氨基酸分子量为46.95kDa,理论等电点为8.99,无跨膜结构及信号肽,在ORF末端有4个锌指结构,并且编码KTS三肽。基因表达结果表明：wt1a和wt1b基因主要在圆斑星鲽性腺中表达,精巢的表达高于卵巢,肾脏的表达量显著高于其他组织,推测wt1a基因和wt1b基因在性腺和肾脏发育过程及功能方面均发挥重要作用;在早期发育阶段,wt1a基因在原肠期之前微弱表达,从原肠早期开始逐渐上升至神经胚期表达量达到最高,之后逐渐下降,直至孵化阶段,推测wt1a基因在圆斑星鲽原始生殖细胞分化过程及性腺发育中发挥重要作用。     

三斑石斑鱼(Epinephelus trimaculatus)两种芳香化酶cDNA的克隆及其表达的组织特异性

通过设计引物,从三斑石斑鱼的卵巢中克隆鉴定出性腺芳香化酶(EtP450arom a)和脑芳香化酶(EtP450arom b)的cDNA序列,EtP450arom a开放阅读框为1557bp,编码519个氨基酸残基;EtP450arom b开放阅读框为1530bp,共编码510个氨基酸残基;性腺芳香化酶(EtP450arom a)和脑芳香化酶(EtP450arom b)的氨基酸序列的同源性为63.3%,并且包含了芳香化酶经典的功能保守结构。构建了芳香化酶的系统进化树。采用半定量RT-PCR方法研究了性腺芳香化酶(EtP450arom a)和脑芳香化酶(EtP450arom b)在雌性成鱼各组织中的mRNA的表达情况。组织表达结果显示,性腺芳香化酶EtP450arom a只在性腺中特异性表达,而脑芳香化酶EtP450arom b主要在脑区和垂体中表达,表明三斑石斑鱼两种芳香化酶基因的组织特异性及功能的差异。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)foxl2基因功能初探及相关miRNA分析

foxl2在脊椎动物卵巢分化、发育和功能维持等方面具有重要作用,然而其在三疣梭子蟹(Por-tunus trituberculatus)卵巢发育中的功能尚不明确.本研究首先克隆了三疣梭子蟹foxl2(Ptfoxl2)基因cDNA全长序列,该基因5′和3′非编码区域(UTR)长度分别为701?bp和211?bp,开放阅读...     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)CYP2基因的cDNA克隆及表达分析

通过RT-PCR及Smart?TM Race技术,首次克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)CYP2基因cDNA全长序列。该基因cDNA全长1662bp,编码一个由492个氨基酸组成的多肽,预测理论等电点为6.348,分子量大小为56.68kD。氨基酸序列中含有CYP基因家族所特有的K螺旋保守序列(ExxR)和血红素结合区(FxxGxxxCxG)。经氨基酸序列比对及系统进化树分析发现,与岸蟹(Carcinus maenas)的同源性最高,达到75%。实时荧光定量PCR结果表明,CYP2基因在肝胰腺、鳃、肌肉、血淋巴、心脏和眼柄中均有分布,在肝胰腺中表达量最高。肌肉注射磺胺嘧啶后,三疣梭子蟹高、中、低三剂量组CYP2基因表达较对照组都有上调,并具有时间差异性,低剂量组表达量逐渐降低,趋于对照组,中剂量组和高剂量组表达量先升高后降低,6h后同一时间点,均是高剂量组表达最高,低剂量组最低。表明磺胺嘧啶可诱导三疣梭子蟹CYP2基因,CYP2基因可能参与三疣梭子蟹的药物代谢反应。     

日本新糠虾(Neomysis japonica)卵巢发育与卵子发生

结合日本新糠虾雌性生殖系统的解剖特征和组织结构特点,首次对日本新糠虾卵巢发育及卵子发生进行分期,并对各期卵巢发育时间及卵巢长与体长间相互关系进行分析。结果表明,日本新糠虾雌性生殖系统由卵巢和输卵管组成。卵巢呈“H”形,分左右两叶,两叶间有呈近三角形横桥连接,横桥内侧为生殖上皮。卵巢实质不分叶,卵细胞由横桥向两侧卵巢迁出并逐渐发育变大。卵子的发生经历5个阶段,分别为卵原细胞、卵黄合成前期卵母细胞、内源性卵黄合成期卵母细胞、外源性卵黄合成期卵母细胞和成熟期。滤泡细胞随着卵细胞的迁移而迁移,卵细胞发育后期出现滤泡细胞与卵母细胞相融合现象。卵巢发育分为5个时期,分别为未分化期（以卵原细胞为主,约为孵化后的18d）、小生长期（以内源性卵黄合成期卵细胞为主,约为孵化后的22d）、大生长期（以外源性卵黄合成期卵细胞为主,约为孵化后的25d）、成熟期（以成熟卵细胞为主,约为孵化后的28d）和退化期（为排卵后卵巢,约为孵化后的32d）。退化期卵巢中未见有结缔组织增生,而实质中存在着大量早期卵细胞,滤泡细胞呈多层分布于卵细胞周围。输卵管自卵巢末端生出,开口于第6胸肢基部内侧腹甲上,随卵巢发育,管腔渐增大。日本新糠虾卵巢长与体长间有正相关。     

曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)促性腺激素释放激素(GnRH)基因的鉴定、特征及成熟期的表达研究

促性腺激素释放激素（GnRH）在脊椎动物的繁殖过程中起着至关重要的作用,同时也存在于许多无脊椎动物中。利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）克隆出曼氏无针乌贼（Sepiella japonica）促性腺激素释放激素（命名为SjGnRH,KP 982885.1）。SjGnRH基因的cDNA全长710 bp,开放阅读框（ORF）为273 bp,编码90个氨基酸,包括一条含有31个氨基酸的信号肽、12个氨基酸的GnRH多肽和44个氨基酸的GnRH相关肽（GAP）;SjGnRH与剑尖枪乌贼（Uroteuthis edulis）和真蛸（Octopus vulgaris）的同源性分别为86.7%和73.3%;SjGnRH高度保守的十二肽与剑尖枪乌贼和真蛸的octGnRH相似度达100%,其信号肽的相似性分别为66.7%和54.8%,GAP区的相似性分别为95.5%和77.3%;实时荧光定量PCR（qRT-PCR）结果显示,SjGnRH基因在成熟期的表达具有特异性,在脑中表达量最高,且与其他组织差异显著（P<0.05）;采用原位杂交技术检测SjGnRH mRNA在脑内的表达模式,结果表明：SjGnRH在食道上神经团、食道下神经团和视叶的不同部位均有表达,暗示SjGnRH可能参与曼氏无针乌贼的生殖调控作用。