苗期中国对虾幼体异养细菌区系及其变化与病害发生的关系

研究了2个育苗场不同发育期的中国对虾(Penaeus chinensis)幼体的异养菌和弧菌种群变化的动态过程。以典型特征法、BIOLOGGN法和数值分类法对菌株进行鉴定。结果表明，对虾幼体样品中所分离的细菌，大多是革兰氏阴性杆菌。鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas)、气单胞菌属(Aeromonas)和弧菌属(Vibrio)。弧菌属主要为溶藻弧菌(Vibrioal-ginozyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)。在对虾幼体发育早期，假单胞菌(Pseudomonas)和气单胞菌(Aeromonas)占优势，随着对虾幼体的发育，弧菌(Vibrio)渐成为优势，其中溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)优势明显。二者的消长与苗期病害的发生相关，溶藻弧菌总是在虾幼体健康时出现或成为优势，而哈维氏弧菌成为优势时，苗期病害容易发生。     

亚甲基蓝对南美白对虾(Pemaeus vannamei Boon)幼体的毒性研究

研究了亚甲基蓝对南美白对虾蚤状幼体、糠虾幼体及仔虾的急性毒性。结果表明,不同发育期的幼体,仔虾对此种消毒剂的耐受力不同。亚甲基蓝对南美白对虾蚤状幼体(Z)的24hLC50、48hLC50和安全浓度分别为:2.88×10-6,0.89×10-6,0.025×10-6;对糠虾幼体(M)的24hLC50、48hLC50和安全浓度分别为:3.39×10-6,1.04×10-6,0.029×10-6;对仔虾(P)的24hLC50、48hLC50和安全浓度分别为:6.76×10-6,2.24×10-6,0.073×10-6。     

中国对虾幼体和仔虾消化酶活力及氨基酸组成的研究

于1987年5月初在山东日照市涛雒对虾育苗场采集中国对虾虾苗;成虾于1986年春、秋两季取自青岛胶州湾水域的网捕成虾。以酶学分析方法作试验。结果表明,1.虾苗酶活力结果为:类胰蛋白酶及胃蛋白酶的活性有差异,溞状幼体期<糠虾幼体期<仔虾期;酶活性随着生长发育而增高,类咦蛋白酶活性比胃蛋白酶高4倍左右。淀粉酶的活性是溞状幼体期>糠虾幼体期>仔虾期;纤维素酶活力极微;淀粉酶活性是纤维素酶的6—13倍左右。育苗期几种消化酶的活性均远远低于成虾。2,育苗期幼虾的氨基酸含量,随着生长发育而增高,在各期,氨基酸总和的差别是:溞状幼体期<糠虾幼体期<仔虾期。     

新一代喹诺酮药物防治中国对虾幼体细菌性疾病的试验

新一代喹诺酮药物——6—F—喹啉—3—羧酸(商品名齐复康Ⅱ号)对中国对虾幼体的毒性,蚤状幼体、糠虾幼体、仔虾24hLC_(50)分别为16.3、21.3、45.8(×10~(-6));48hLC_(50)分别为8.1、12.5、30.0(×10~(-6));安全浓度(SC)分别为0.6、1.3、3.8(×10~(-6))。试验表明此药对防治对虾幼体细菌性疾病效果明显。0.5×10~(-6)。每天施药一次,连续三天,育苗池水中细菌总数由30750ind./ml减少到6850ind./ml,其中在TCBS培养基上能生长的细菌由22400ind./ml减少到1090ind./ml。     

中国对虾育苗期球形病毒的感染及垂直传播途径的初步探讨

１９９４－１９９５年山东文登市高岛盐厂对虾育苗池和养虾池,随机和定点采集中国对虾的卵,无节幼体,蚤状幼体,糠虾幼体,仔虾及幼虾,成虾样品,利用透射电子显微镜对其进行病毒的检测。结果表明,卵细胞中含有大量的卵黄,没有明显的细胞分化,卵细胞质中有球形病毒感染;无节幼体的肝胰腺和上皮细胞的分化程度较低,有大量球形病毒分布;糠虾幼体已有明显的肝胰腺和上皮细胞的分化,肝胰腺上皮细胞的胞质中发现有球形病毒包涵     

蜕皮与中国对虾仔虾肠道杆菌病及肠道堵塞的关系

于１９９６年５月,在青岛市红岛镇后阳育苗场,采用饲养实验的方法对患肠道疾病的中国对虾仔虾的康复进行观察研究。结果表明,中国对虾仔虾的某些肠道疾病的康复与蜕 存在极为密切的关系。肠道杆菌病对虾状幼体和糠虾幼体危害极大,患病个体死亡率为１００％,而患病率的仔虾幼体较高的存活率（３２％）,存活者多数为病症出现时已处蜕皮前期的个体,而在蜕皮间期开始患病的个体极少能发育至蜕皮变态。肠道堵塞是仔虾期纪体的幼体     

4株对虾肠道益生菌的筛选及鉴定

采用体外拮抗试验的方法，先从不同生长阶段的对虾肠道中分离的96株细菌中筛选出4株对病原菌（鳗弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌）有拮抗作用的细菌；进一步通过固体扩散法和液体混合法确定LV060806、LV060808的产物对鳗弧菌有明显抑制作用，Lv060806、LV060815的产物对副溶血弧菌有明显抑制作用，LV060810、LV060815的产物对哈维氏弧菌有明显抑制作用。溶血试验证实这些菌株不产生溶血素，不具有潜在的致病性；动物安全性实验证实菌株浓度在10^6 cfu／ml以下对实验对虾无明显的毒害作用。随后测定了其16S rRNA基因序列，分析了相关细菌相应序列的同源性，构建了系统发生树，结合菌株表型特征和生理生化特性最终鉴定结果为：LV060806、LV060808为Vibrio natriegens；LV060810、LV060815为V.alginolyticus。     

不同条件下哈维氏弧菌(Vibrio harvey)对墨吉明对虾(Fenneropenaeus merguiensis)致病性研究

为研究墨吉明对虾弧菌病的防控方法, 本文通过人工注射感染的方式, 研究不同数量哈维 氏弧菌及在不同温度、盐度、pH、不同硝酸氮、亚硝酸氮和氨氮浓度条件下哈维氏弧菌对墨吉明对 虾的致病性的影响。结果表明: 当人工感染哈维氏弧菌数量为3.16×10⁸ CFU 时, 24 h 内对虾累计死 亡率为96.67%; 哈维氏弧菌数量为3.16×10⁶ CFU 以上, 实验结束时, 对虾累计死亡率都超过了 50.00%.在20-32℃ 范围内, 随着温度升高哈维氏弧菌致病力增强, 并且低温组(20℃ 实验组与 26℃ 实验组)对虾累计死亡率显著低于高温组(32℃ 实验组)(P<0.05).在温度为(24±1)℃ 时, 盐度为 20 时对虾累计死亡率处于较低水平; 在温度为(24±1)℃, 盐度为(22±1)时, 96 h, pH 为8.0 时对虾 累计死亡率最低, 并且与另外两个实验组差异显著(P<0.05); 温度为(24±1)℃, 盐度为(22±1), 硝 酸氮对感染哈维氏弧菌的墨吉明对虾有胁迫作用; 在亚硝酸氮浓度(1.0-10.0 mg/L)、氨氮浓度 (0.5-1.5 mg/L)范围内, 哈维氏弧菌对墨吉明对虾的致病性, 随着浓度升高而增强。本实验为墨吉明 对虾弧菌病的防控提供了理论基础。     

亚硝酸盐对长毛对虾幼体的毒性

长毛对虾幼体从无节幼体至仔虾期对亚硝酸盐的忍耐性依次增强。在盐度３２，ｐＨ８．２０和水温２８±０．５℃的条件下，无节，蚤状，糖虾，仔虾２４ｈ的ＬＣ５０值分别为７．６３，１５．０９，２２．９２和６４．５８ｍｇ／ｄｍ＾３ＮＯ２２－Ｎ；蚤状，糖虾，仔虾４８ｈ的ＬＣ５０值分别为１１．９，１１．４１和３７．３４ｍｇ／ｄｍ＾３ＮＯ２－Ｎ；仔虾７２ｈ和９６ｈ的ＬＣ５０值分别为２２．９４和１３．８１ｍｇ／ｄｍ＾３     

中国对虾育苗池水中哈维氏弧菌的检测

１９９６年４月～５月,在山东莱州市大华育苗池、山东即墨市丰城育苗场发病育苗池、环境水体及活体饵料中共采集８０份样品,用间接ＥＬＩＳＡ技术对其进行了苗期对虾病原菌－哈维氏弧菌的检测。结果表明,发病育苗池中哈维氏弧菌的检出率（５８．３％）明显高于正常育苗池（２０．４％）,证实丰城对虾育苗场暴发的流行病与育苗水体中的哈维氏弧菌有关;大华育苗场育苗水中也检测出哈维氏弧菌,但大华育苗场并未发病,说明哈维氏弧菌似乎是条件致病菌。在丰城育苗场及大华育苗场的蓄水池中均检测到哈维氏弧菌,而活性饵料中未检出,表明育苗水中的哈维氏弧菌来源于外海水。     

刺参肠道微生物组成分析及产酶、溶血性试验

对野生和人工养殖刺参的肠壁及内容物中的菌群数量、种类组成进行了研究;并结合产酶试验和溶血性试验,对刺参肠道益生菌做了初步的体外筛选。结果表明,野生刺参肠壁及内容物中的细菌数量分别为(3.30±0.41)×107 cfu/g、(6.39±0.32)×107 cfu/g,养殖刺参肠壁及内容物中的细菌数量分别为(2.83±0.31)×107 cfu/g、(5.67±0.53)×107 cfu/g。野生刺参肠道优势菌为弧菌属(Vibrio),次优势菌为假单胞菌属(Pseudomonas)和希瓦氏菌属(Shewanella);养殖刺参肠道优势菌为弧菌属(Vibrio),次优势菌为假单胞菌属(Pseudomonas)。在224株细菌中,共有160株细菌具有产酶能力,所占比例为71.43%,其中具产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶能力菌株分别为114株、114株、108株,所占比例分别为50.89%、50.89%、48.21%。99株细菌中有23株具有溶血性,所占比例为23.23%。综合分析实验数据,确定6株细菌作为刺参肠道潜在益生菌,菌株代号分别为HS1(Pseudomonas)、HS5(Bacillus)、HS7(Shewanella)、HS8(Vibrio)、HS10(Vibrio)、HS11(Vibrio)。     

盐度对太平洋牡蛎面盘幼虫垂直分布的影响

于1986年夏、秋两季在福建省惠安、罗源采集太平洋牡蛎,以人工授精法获取受精卵,在空调室内研究盐度变化对太平洋牡蛎面盘幼虫趋性行为的影响。结果表明,盐度的提高能促使牡蛎D形面盘幼虫从正趋地性转变为负趋地性,同时幼虫的正趋光性也得到加强。在D形面盘幼虫期,能引起趋光性加强的盐度增加阈值为2.9×10~(-12);在8日龄壳顶面盘幼虫,提高至5.0×10~(-12)以上。当D形面盘幼虫和壳顶面盘幼虫分别从25×10~(-12)移置于30×10~(-12)时,趋光水平能得到明显提高的时间阈值分别为4h和6h。据以上结果,作者认为该种幼虫在河口区有无阻留的主动性取决于该区环境的变化,同时也与幼虫不同发育时期有关。盐跃层的存在对牡蛎幼虫垂直分布的影响表明,只要盐跃层为2.5×10~(-12),即能抑制幼虫的向上游泳;一旦盐跃层增加,其阻抑作用仍维持接近低盐跃层水平。这说明盐跃层的存在对牡蛎幼虫的垂直迁移具有重要作用。     

环境因子对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)粘附大黄鱼(Pseudosciaena crocea)表皮粘液影响的研究

采用3H-TdR同位素示踪方法研究了环境因子对溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液粘附作用的影响。试验结果表明,溶藻弧菌能很好地粘附于大黄鱼表皮粘液,其粘附量在菌浓度不超过6.52×108cfu/ml情况下随菌浓度的升高而升高;粘附量在25℃下孵育180min趋于饱和,在180min以内与孵育时间呈正相关关系;粘附作用在温度25—30℃、pH值偏酸、盐度35条件下较强;在无Na (盐度为0)时,无粘附作用;Ca2 能显著加强溶藻弧菌的粘附作用,而Mg2 作用不明显。这些结果表明,溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液有较强的粘附作用,其粘附作用受温度、盐度、pH值等环境因子的影响。     

哈维氏弧菌对泥蚶的毒性及半致死浓度研究

为构建泥蚶感染弧菌标准技术体系,本研究采用哈维氏弧菌浸泡感染和注射胁迫两种攻毒方式对泥蚶进行了急性毒性实验,观察泥蚶在菌液胁迫下的存活情况,分析哈维氏弧菌对泥蚶的半致死浓度。浸泡感染实验结果表明,随着感染水体中弧菌升高,泥蚶死亡起始时间和最大日死亡率时间均有所提前,泥蚶死亡情况呈现上升趋势,当浸泡浓度超过2×10⁷CFU/mL,泥蚶15 d累计死亡率接近100%。注射胁迫实验结果表明,泥蚶死亡率与弧菌注射浓度呈显著正相关(r=0.964,P<0.01)。Probit回归分析结果显示,哈维氏弧菌浸泡感染泥蚶7 d后停止实验,15 d的半致死浓度(LC₅₀)为1.35×10⁷CFU/mL;注射胁迫下的96 h半致死剂量(96 h LD₅₀)为2.12×10⁷CFU/g,说明哈维氏弧菌对泥蚶有明显的毒害作用。研究结果为泥蚶对哈维氏弧菌耐受性提供数据参考,并且为泥蚶弧菌病防治提供了理论基础。     

冬季刺参养殖环境与肠道内细菌菌群的研究

运用传统细菌分离培养与分子生物学技术相结合的方法,对2008年11月至2009年1月冬季刺参(Apostichopus japonicus Liao)养殖池塘环境(养殖水、底泥、附着基)及刺参肠道内的细菌菌群进行了分析。应用平板稀释涂布培养计数法测得刺参养殖池塘水体、底泥、附着基和肠道细菌数量分别为0.75×102～1.4×104cfu/mL、8.7×104～8.1×105cfu/g、3.8×105～2.8×106cfu/g、7.1×105～1.5×107cfu/g;根据形态学差异从培养所得的细菌中筛选得到22株菌,用限制性内切酶Rsa I和Msp I对所分离菌株进行ARDRA(Amplified rDNA Restriction Analysis)分析,这22株菌被分为8种不同的分类单元(Operational Taxonomic Unit,OTU),其中OTU2与OTU3所包含的菌株分别占分离菌株种数的30%和20%;此外,作者对不同环境培养所得的优势度最高的细菌进行分子鉴定分析。结果表明:水环境中优势菌为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)及巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium),沉积物中优势菌为巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis),附着基中优势菌为巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis),灿烂弧菌(Vibrio splendidus),肠道中优势菌为巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis),灿烂弧菌(V.splendidus)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)。通过对冬季刺参池塘细菌菌群多样性分析和优势菌鉴定,为筛选低温益生菌和防治刺参疾病提供了有益参考。     

粤东养殖区分离的2株海洋弧菌及其胞外产物对皱纹盘鲍致死毒性的初步分析

2011年秋,福建和广东地区养殖的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)相继暴发死亡。同年12月,我们从广东汕头病区取样分离得到2株弧菌,其中bb3为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus), bb4为哈氏弧菌(V. harveyi)。本研究以bb3、bb4作为供试菌株对1龄皱纹盘鲍进行侵染实验,获得如下结果：20℃条件下,供试菌及其胞外产物粗提液注射处理均可致受试鲍死亡,浓度2.5×107 cfu/mL 的 bb3与2.0×107cfu/mL的bb4悬液注射可分别引发43.33%和78.02%的受试鲍死亡;供试菌株的致死毒性与注射弧菌的总量正相关,与受试幼鲍的壳长、全湿重负相关;注射或浸泡-创伤两种处理方式均可导致受试鲍死亡,并且因注射供试弧菌而死亡的幼鲍软体部组织被健康鲍取食后也可引发取食者死亡;从侵染实验死亡的受试鲍软体部组织中可重新分离得到这2种供试弧菌。上述结果表明,溶藻弧菌 bb3和哈氏弧菌bb4是皱纹盘鲍的病原菌。药敏试验表明, bb3、bb4均已对抗生素具有一定程度的耐药性,在测试的20种抗生素中,仅有头孢曲松和丁胺卡那霉素是这2株弧菌同时高度敏感的抗生素,但bb3和bb4却对8种抗生素同时表现出抗性。     

矛尾复虾虎鱼溃疡病病原创伤弧菌的鉴定

2009年8月江苏连云港赣榆县多家虾蟹养殖塘混养的矛尾复虾虎鱼（砂nechogobius hasta）大量死亡．从病鱼深层溃烂组织及肝脏中分离出大量优势生长的细菌,人工感染试验证明分离菌对虾虎鱼的半数致死量（LD,0）为1．63×10^6cfu／g。对分离菌进行了形态特征、理化特性和分子生物学等方面的分析。一方面．分离...     

以16S和16S—23S rDNA间区为靶区建立副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) PCR快速检测技术

提要应用BLAST程序和DNAstar软件,比较分析了5株副溶血弧菌和其他细菌的16S—23S rDNA间区序列,选取IGSIA作为扩增靶区,结合相邻的16S rDNA序列,设计合成了一对特异性引物,通过优化扩增条件,建立了快速检测副溶血弧菌的PCR方法,对其特异性和敏感性进行了探讨,并初步进行了应用研究。结果表明,新建的PCR方法能特异性地扩增出大小为306bp和552bp的2条带,分别对应于副溶血弧菌的IGS0和IGSIA,检测灵敏度为5.6×102CFU/ml,半个工作日即可得到准确的结果,能有效检测出在杂色鲍、凡纳滨对虾和各种水质中的副溶血弧菌,适用于海洋水产动物副溶血弧菌病的早期快速诊断、水产品的检疫及水质环境的监测。     

皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)肠道潜在益生菌的筛选及对幼鲍生长的影响

采用体外实验筛选益生菌结合16SrDNA序列分析法,从124株不具有溶血作用的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)肠道细菌中筛选得到5株潜在益生菌并进行了分子鉴定,进一步对5株潜在益生菌进行了安全性实验及体内饲喂实验。结果表明,2株具有拮抗哈维弧菌和灿烂弧菌能力的潜在益生菌分别被鉴定为Shewanella sp.(WA64)和Shewanella sp.(WA65),一株产海藻酸酶和淀粉酶的潜在益生菌被鉴定为Vibrio sp.(WA51),产蛋白酶潜在益生菌被鉴定为Bacillus sp.(FA12),产琼脂酶潜在益生菌被鉴定为Tamlana sp.(FA86);安全性实验表明5株潜在益生菌在107cfu/ml下对皱纹盘鲍没有明显的毒害作用;通过体内饲喂实验发现,潜在益生菌WA64、WA65的复合作用能够显著提高幼鲍增重率和存活率(P<0.05),并在生产条件下能够明显降低幼鲍的死亡量。经抗生素敏感性实验,WA64菌株对15种抗生素均敏感或中度敏感,WA65菌株仅对庆大霉素和链霉素2种抗生素产生耐药。     

广东沿海香港牡蛎消化道异养菌统计及其耐药性研究

本研究针对高温时期(6月、9月)广东沿海地区的香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)体内异养细菌总数和弧菌总数进行了深入的调查,并由添加单种抗生素(分别是:庆大霉素、呋喃唑酮、利福平、环丙沙星、恩诺沙星、氯霉素、复方新诺明)的培养基中分离得到310个菌株。进一步采用纸片扩散法(kirby-bauer法)针对常见的抗生素对此310个菌株进行药敏测试,了解不同来源菌株的耐药状况。结果表明310个菌株分属48个不同种属,主要是肠杆菌(Enterobacter)、弧菌(Vibrio)、芽孢杆菌(Bacillus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella)、希瓦氏菌(Shewanella)、不动杆菌(Acinetobacter)、假单胞菌(Pseudomonas)、短波单胞菌(Brevundimonas)、发光杆菌(Photobacterium)、黄杆菌(Tenacibaculum)、盐单胞菌(Halomonas)等。在9月份从牡蛎体内分离的异养细菌比6月份分离的异养细菌高出1～2个数量级(除台山外)。6月份从台山地区牡蛎分离的异养细菌数(2.6×10~6～5.8×10~6 cfu/g)最多,高出其他地区1～3个数量级。药敏测试结果显示牡蛎体内异养细菌对20种抗生素普遍存在抗性,尤其对青霉素、卡拉霉素、呋喃唑酮、阿莫西林、克林霉素及万古霉素表现出较高的耐药率。高温时期(6月、9月)分离的异养菌大多数为多重耐药细菌,其比例分别为84.18%和91.72%。本研究将为牡蛎养殖业的疾病控制以及水产养殖中细菌的耐药状况提供重要参考依据。