高温胁迫对皱纹盘鲍幼鲍免疫因子的影响

为培育抗逆性强的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino),选取经过选育的皱纹盘鲍进行试验,评价其对高温的耐受性。试验共设置4个温度梯度,其中自然水温组(22℃)A为对照组,其他3组高于最适温度,分别为B组25℃、C组28℃以及D组31℃。研究不同温度组幼鲍体内几种免疫因子(AKP,ACP,SOD,LZM等)的变化情况,最终结果显示所选皱纹盘鲍幼鲍体内SOD,LZM,ACP活性有随温度的升高而升高的变化趋势,而AKP的活性在31℃组有轻微下降。总体结果表明,在试验控制的温度范围内该种鲍可以通过自身免疫因子的变化来抵抗高温带来的伤害。     

中国海耳鲍胚胎发育特征

利用显微技术对耳鲍(Haliotis asinineLinnaeus)的胚胎发育进行了研究,同时观察到孵化后的担轮幼虫。结果表明,耳鲍胚胎发育过程与皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)和杂色鲍(Haliotis diversicolor)基本相似,胚胎发育过程分为受精期、第一极体放出期、第二极体放出期、2细胞期、4细胞期、8细胞期、16细胞期、32细胞期、桑椹期、原肠期和未孵化的担轮幼虫期。在海水质量密度1.024,水温28℃的条件下,耳鲍完成胚胎发育历时约5 h 30 min,比皱纹盘鲍(海水质量密度1.022～1.023,水温22.5℃)、杂色鲍(海水质量密度1.022～1.023,水温24～26℃)分别快1.5～2.5 h和0.5 h。耳鲍成熟卵卵径为0.18～0.19 mm,担轮幼虫具有1束顶毛和2个纤毛环带。     

几种诱导物质对皱纹盘鲍幼虫变态的相互作用

本文研究用不同浓度的氯化钾（ＫＣｌ）、γ－氨基丁酸（ＧＡＢＡ）和足粘液相结合对皱纹盘鲍幼虫变态的影响，从中找出皱纹盘鲍幼虫诱导变态的最佳条件，为人工育苗提供科学依据。     

皱纹盘鲍杂交幼鲍闽东内湾度夏初探

为探讨皱纹盘鲍杂交鲍幼鲍在闽东内湾度夏的生长与存活,以山东荣成两家育苗场培育的皱纹盘鲍Haliotis discus hannai杂交鲍幼鲍(XXK、DY)、福建东山岛培育的盘鲍H.discus discus幼鲍(DS)为材料,分别运输至福建霞浦内湾长腰海区、山东荣成爱连湾进行度夏培育.各幼鲍组XXK、DY、DS均为1龄苗种,起始壳长分别为31.51 mm±2.66 mm、30.76 mm±3.30 mm、30.63 mm±2.57 mm,且无显著性差异(P<0.05).经过6个月的培育,在南方闽东内湾培育条件下,皱纹盘鲍杂交鲍幼鲍组壳长的日增长率达95.34 μm/d±29.14μm/73.81 μm/d±29.37 μm/d,存活率为50.06%±0.25%、49.88%±0.17%;盘鲍组壳长的日增长率则为65.81 μm/d±29.71μm/d,存活率为28.81%±4.87%.作为对照,在北方培育条件下,皱纹盘鲍杂交鲍幼鲍组壳长的日增长率达67.85μm/d±29.01μm/d、63.749 μm/d±22.99 μm/d,存活率为78.90%±2.24%、86.56%±2.98%;盘鲍组壳长的日增长率则为27.87μm/d±29.21μm/d,存活率为43.19%±1.85%.双因素方差分析结果表明养殖环境与幼鲍来源,以及两者的交互作用均显著影响幼鲍度夏的生长发育.本研究结果对皱纹盘鲍杂交幼鲍在南方闽东内湾的养成提供了一定的参考.     

几种环境因子对皱纹盘鲍的胁迫作用及其阈值

针对福建等海域养殖皱纹盘鲍度夏死亡率高的现象,试验研究了不同盐度、温度和溶解氧条件,对皱纹盘鲍幼鲍和1龄鲍死亡率的影响,并根据试验结果设定了皱纹盘鲍海上养殖盐度、温度和溶解氧预警阈值。结果表明:低盐胁迫对皱纹盘鲍的死亡率影响显著,在水温24～27℃时,盐度20是幼鲍和1龄鲍试验组和对照组死亡率有显著差异的临界点,盐度预警阈值为22;高温胁迫对皱纹盘鲍的死亡率影响显著,温度28℃是幼鲍和1龄鲍试验组和对照组死亡率有显著差异的临界点,温度预警阈值为27℃;皱纹盘鲍有较强的耐低氧能力,在水温26℃,盐度为30,溶解氧低于2.0mg/L时,开始大量死亡,溶解氧预警阈值为3.5mg/L;高温胁迫和低盐胁迫对皱纹盘鲍的死亡率有显著的交互作用,温度升高,低盐耐受能力下降。     

几种环境因子对波纹巴非蛤面盘幼虫发育的影响

采用实验生态的方法研究了饵料密度、温度和盐度对波纹巴非蛤面盘幼虫的影响。结果表明,球等鞭金藻密度为3×10~4个/m L是波纹巴非蛤面盘幼虫培育的最佳饵料密度;面盘幼虫培育的适宜温度为24~30℃,最适为27~30℃;适宜盐度为27~33,最适为30。实验结果可为建立波纹巴非蛤人工育苗技术参考。     

不同养殖方式对皱纹盘鲍养殖效果及养殖水质的影响

在天津地区对2.2 cm左右规格的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)进行试养殖,比较了两种养殖模式(笼养与砖养)、两种养殖密度下鲍的存活与生长情况,以及不同换水频率和不同饲料形状对鲍的生理状态和养殖水质的影响。结果表明:试养殖1个月后,笼养下的鲍存活率(74.4%)低于砖养(84.0%),且低密度养殖下鲍的存活率更高;随着换水频率的增加,鲍的摄食量逐渐增加,养殖水体中氨氮、亚硝酸氮、硝酸氮、化学需氧量的含量均呈减少的趋势;投喂不同形状饲料的组别间养殖水体氨氮、亚硝酸氮含量差异显著。因此,砖养模式更适合于作为天津地区鲍养殖的模式,并且降低密度、提高换水频率有助于改善水质,改良鲍的摄食、存活状况。     

粤东养殖区分离的2株海洋弧菌及其胞外产物对皱纹盘鲍致死毒性的初步分析

2011年秋,福建和广东地区养殖的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)相继暴发死亡。同年12月,我们从广东汕头病区取样分离得到2株弧菌,其中bb3为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus), bb4为哈氏弧菌(V. harveyi)。本研究以bb3、bb4作为供试菌株对1龄皱纹盘鲍进行侵染实验,获得如下结果：20℃条件下,供试菌及其胞外产物粗提液注射处理均可致受试鲍死亡,浓度2.5×107 cfu/mL 的 bb3与2.0×107cfu/mL的bb4悬液注射可分别引发43.33%和78.02%的受试鲍死亡;供试菌株的致死毒性与注射弧菌的总量正相关,与受试幼鲍的壳长、全湿重负相关;注射或浸泡-创伤两种处理方式均可导致受试鲍死亡,并且因注射供试弧菌而死亡的幼鲍软体部组织被健康鲍取食后也可引发取食者死亡;从侵染实验死亡的受试鲍软体部组织中可重新分离得到这2种供试弧菌。上述结果表明,溶藻弧菌 bb3和哈氏弧菌bb4是皱纹盘鲍的病原菌。药敏试验表明, bb3、bb4均已对抗生素具有一定程度的耐药性,在测试的20种抗生素中,仅有头孢曲松和丁胺卡那霉素是这2株弧菌同时高度敏感的抗生素,但bb3和bb4却对8种抗生素同时表现出抗性。     

盘鲍和皱纹盘鲍等位酶的生化遗传分析

应用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对盘鲍(Haliotis discus discus)和皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)的养殖群体进行了10种等位酶的电泳检测和谱带遗传分析。确定了盘鲍的18个等位酶位点及21个等位基因,单态位点有15个;仅有3个位点是多态的,它们是Sod-1,Est-3,Mdh-1(P0.99标准),多态位点的百分数为16．67％,这些多态位点分析到2个等位基因。确定了皱纹盘鲍的18个等位酶位点及20个等位基因,单态位点有16个;仅有2个位点是多态的,它们是Sod-1,Est-3(P0.99标准),多态位点的百分数为11．11％,这些多态位点中也分析到2个等位基因。盘鲍和皱纹盘鲍在所有位点中共享大多数常见等位基因,因此在生化遗传上它们非常相似。该研究揭示了盘鲍和皱纹盘鲍养殖群体等位酶位点及其等位基因带谱的变异式样,为盘鲍和皱纹盘鲍的遗传结构及遗传育种的研究提供了一批等位酶位点及其等位基因的参考图谱。     

不同孵化方式、培育密度和附着基对瘤背石磺人工繁育的影响

为提高瘤背石磺(Onchidium struma)在胚胎发育和幼虫发育过程中受精卵的孵化速率和幼虫的存活率, 本试验模拟滩涂生态环境对瘤背石磺亲贝进行人工养殖, 并促使其交配产卵。将采集的瘤背石磺新鲜卵块置于盐度18, 水温25～26 ℃的水体中进行孵化。比较3 种不同孵化方式对孵化速率的影响, 并研究不同孔径(1.0～1.5 mm)海绵附着基和不同培育密度对幼虫存活率的影响, 同时结合幼虫在各水层中分布的变化规律, 探索瘤背石磺胚胎发育和幼虫发育过程的关键技术。结果显示, 采用3 种方式(“喷淋”、“露空”和“梯笼”)孵化, 受精卵至出膜面盘幼虫期所需时间分别为8、6 和9 d; 大孔径(1.2～1.5 mm)海绵组对幼虫的附着效果较好, 存活率显著高于小孔径(1.0～1.2 mm)海绵组(P<0.05),且两者均显著高于未添加附着基组(P<0.05); 存活率与不同培育密度的二次多项式回归分析显示, 瘤背石磺幼虫培育密度为55～61 个/mL 时存活率较高。上述结果表明, “露空”孵化方式能显著缩短瘤背石磺孵化所需时间; 在生产过程中, 幼虫培育密度以55～61 个/mL 为宜, 面盘幼虫期投放大孔径海绵作为幼虫附着基能显著提高幼虫存活率且能明显缩短胚胎发育和幼虫发育所需时间。     

基于皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)EST数据库的串联重复序列特征分析

皱纹盘鲍大规模EST的分析研究较少,为了研究其基因组转录本的基本特征并为皱纹盘鲍中开发EST-SSR功能性标记奠定基础,我们利用生物信息学手段对NCBI公共数据库中的5784条皱纹盘鲍EST序列进行EST-SSR特征分析。分析结果表明:(1)皱纹盘鲍EST中串联重复序列类型丰富;(2)皱纹盘鲍EST Gene Ontology注释序列SSR类型单一;(3)皱纹盘鲍EST-SSR分布广泛富,是EST-SSR标记开发的优良资源。     

饲料中硒和α-硫辛酸对皱纹盘鲍稚鲍抗氧化反应的影响

本研究利用2×3双因素试验设计,分别添加0和1 mg/kg的硒,0、800和3 200 mg/kg的α-硫辛酸,配制成6种半精制饲料,在流水系统中养殖初始体质量为(0.43±0.00)g的皱纹盘鲍稚鲍(Haliotis discus hannaiIno)16周,探讨硒和硫辛酸对皱纹盘鲍稚鲍抗氧化反应的影响。结果表明:硒对皱纹盘鲍肝胰脏中谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和总抗氧化力(T-AOC)有显著影响,当饲料中不添加硫辛酸时,硒显著提高了肝胰脏GPX活性及T-AOC值。饲料中添加800 mg/kg硫辛酸时,皱纹盘鲍肝胰脏中的GPX活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性和T-AOC值均显著增加,谷胱甘肽(GSH)的含量也有所增加,但差异不显著。然而,添加3 200 mg/kg硫辛酸时,GPX活性和T-AOC值显著下降。尽管没有统计学上的显著差异,饲料中硒和硫辛酸对皱纹盘鲍稚鲍抗氧化反应的影响表现出了潜在的交互作用。总的来说,饲料中同时添加1mg/kg硒和800 mg/kg硫辛酸时,皱纹盘鲍稚鲍能够表现出较好的抗氧化状态。     

皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)肠道潜在益生菌的筛选及对幼鲍生长的影响

采用体外实验筛选益生菌结合16SrDNA序列分析法,从124株不具有溶血作用的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)肠道细菌中筛选得到5株潜在益生菌并进行了分子鉴定,进一步对5株潜在益生菌进行了安全性实验及体内饲喂实验。结果表明,2株具有拮抗哈维弧菌和灿烂弧菌能力的潜在益生菌分别被鉴定为Shewanella sp.(WA64)和Shewanella sp.(WA65),一株产海藻酸酶和淀粉酶的潜在益生菌被鉴定为Vibrio sp.(WA51),产蛋白酶潜在益生菌被鉴定为Bacillus sp.(FA12),产琼脂酶潜在益生菌被鉴定为Tamlana sp.(FA86);安全性实验表明5株潜在益生菌在107cfu/ml下对皱纹盘鲍没有明显的毒害作用;通过体内饲喂实验发现,潜在益生菌WA64、WA65的复合作用能够显著提高幼鲍增重率和存活率(P<0.05),并在生产条件下能够明显降低幼鲍的死亡量。经抗生素敏感性实验,WA64菌株对15种抗生素均敏感或中度敏感,WA65菌株仅对庆大霉素和链霉素2种抗生素产生耐药。     

不同水交换量下皱纹盘鲍转录组测序与分析

养殖过程的循环水交换量能够显著影响皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)的生理状态, 进而影响其养殖存活率和生长率, 然而不同循环水量对于皱纹盘鲍的生理状态影响的分子机制尚不明确。本实验以皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)为研究对象, 将鲍分别置于循环水交换频率为1次/d、2次/d、4次/d的条件下(编号为C0、T2和T4组)暂养3 d, 然后利用Illumina Hiseq 2500技术测定不同处理组鲍鱼的肌肉组织中转录组表达情况。结果表明, 单次换水组(C0)和多次换水组(T2和T4)间差异表达的基因个数较多, 分别为4 095和3 617个, 而T2与T4组之间的差异表达基因个数则较少, 仅为232个。对差异表达基因进行GO和KEGG功能分析显示, 单次换水组(C0)和多次换水组(T2和T4)间差异表达的基因主要集中在能量代谢和免疫反应相关通路或基因, 随机选取10个差异基因进行荧光定量PCR验证, 定量PCR结果与转录谱结果一致, 证实了转录组测序结果的可靠性。本研究说明了更高的水交换量下, 鲍的代谢和免疫相关通路被激活, 可能有助于鲍鱼维持较好的生理和免疫状态, 从而表现出更好的生长、存活等表型。     

水体铜胁迫条件下饲料中硫辛酸对皱纹盘鲍的保护作用

以初始体重(3.17±0.01)g的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)为研究对象,在其饲料中分别添加0、0.7和2.1g/kg的α-硫辛酸配制成3种半精制饲料,在水体Cu含量为0.02mg/L的静水养殖系统中饲养60d,探讨饲料硫辛酸在水体Cu胁迫条件下对皱纹盘鲍的保护作用。结果表明,皱纹盘鲍的特定生长率(SGR)随着饲料中硫辛酸的增加而升高,但与对照组无显著差异。0.7和2.1g/kg硫辛酸处理组皱纹盘鲍的血清、外套膜、鳃和肝胰脏中Cu含量显著低于对照组,2.1g/kg硫辛酸处理组的肌肉中Cu含量显著低于对照组,但是0.7g/kg硫辛酸处理组肌肉Cu含量与对照组无显著差异。硫辛酸的各添加水平显著升高Cu胁迫下皱纹盘鲍的肝胰脏超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)的活力及还原型谷胱甘肽(GSH)的含量。0.7和2.1g/kg硫辛酸处理组的肝胰脏丙二醛(MDA)的含量显著低于对照组。2.1g/kg硫辛酸处理组肝胰脏蛋白羰基的含量和DNA断裂损伤显著低于对照组和0.7g/kg处理组。由此可见,饲料中的硫辛酸可以显著升高Cu胁迫下的皱纹盘鲍肝胰脏抗氧化水平,显著降低皱纹盘鲍组织Cu的沉积量,并在一定程度上减轻了肝胰脏蛋白质、DNA损伤和脂质过氧化。     

高温胁迫下皱纹盘鲍不同养殖群体心率变化比较

高温是海水贝类度夏死亡的环境诱因之一。本研究应用一种非损伤性的心率检测方法,检测两个皱纹盘鲍养殖群体在高温胁迫条件下心率等生理指标的变化,尝试以心率变化指标比较这两个群体高温耐受能力。由于高温胁迫下皱纹盘鲍的心率随温度变化的关系符合阿伦尼乌斯(Arrhenius)公式,且心率随温度上升呈先上升后下降趋势,该研究通过计算两者直线拟合拐点即阿伦尼乌斯拐点温度(ABT,Arrhenius break temperatures)指标,用以指示皱纹盘鲍温度耐受程度。以此法对皱纹盘鲍两个群体(高温耐性,对照)各17个个体进行了测定分析,结果表明:两个群体间的ABT存在显著差异,高温耐性组的皱纹盘鲍的ABT显著高于对照组(P0.05);个体ABT指标的高低与测定个体的壳高呈正相关(P0.05)。本研究首次将探讨了高温胁迫下皱纹盘鲍心率变化规律,并以ABT为指标分析比较了两个皱纹盘鲍养殖群体间高温耐受能力,结果对研究皱纹盘鲍和其它贝类温度胁迫下生理响应及抗逆选育具一定借鉴意义。     

皱纹盘鲍对河流弧菌-Ⅱ苗免疫的研究

于1993-1995年，用免疫法防治皱纹盘鲍脓疱病。河流弧菌-Ⅱ分离自大连水产养殖公司、太平洋海珍品养殖公司的患脓疱病的皱纹盘鲍;健康皱纹盘鲍，由大连水产养殖公司石庙苗种厂提供。鲍血淋巴细胞的体外吞噬实验:取健康皱纹盘鲍的血淋巴与肝素和菌液按一定比例混合后，置湿盒内37℃培养30min，取一滴涂片，吕氏液染色后观察。用该病原菌制做菌苗，大量扩增病原菌，用0.1％-1.0％的甲醛洗下菌苔，处理24-120h，用生理盐水反复清洗，除掉甲醛;再用生理盐水稀释到所需浓度。通过反复传代降低毒性，制成活菌苗。用两种菌苗在稚鲍、一龄鲍（2-3cm）和成鲍（6-8cm）上实验。结果表明，鲍的血淋巴细胞约有三种，三种细胞都有吞噬细菌的能力，有的细胞象变形虫样变形，在细胞膜上吸附着很多细菌，有的细菌已被吞到细胞内;该病原菌可同鲍的血清发生凝集反应;菌苗的效果明显，可提高成活率约50％以上。由上述结果可见，皱纹盘鲍的血淋巴细胞具有吞噬细菌的能力，在菌苗的作用下，血淋巴细胞增殖并活跃地吞噬异源致病菌，同时鲍血液中的免疫因子也被激活，参与免疫的过程，使皱纹盘鲍成活率明显提高。     

皱纹盘鲍三元杂交苗种制备与养成

以皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)中国群体与日本群体的杂交(WJ)子1代为母本,在汕头养殖并选育了3代的“S”群体为父本,建立三元杂交组合(WJ-S)并尝试了海区围堰全生态模式养殖。以同期繁育的皱纹盘鲍中国群体与日本群体的杂交子1代(WJ-F1)为对照,比较 WJ-S 与对照组在生长速度和存活率等方面的差异。结果表明,在苗种和养成阶段, WJ-S 的度夏存活率均显著高于同期对照;从围口壳幼体到养成阶段, WJ-S组的平均壳长大于同期对照,养成阶段WJ-S组的全湿重显著高于对照,表明皱纹盘鲍三元杂交子代的生长速度显著高于对照;从苗种到养成阶段的3次分选数据表明, WJ-S的大规格子代比例均高于对照,小规格苗种比率则低于对照,表明三元杂交鲍苗种的生长速度优于对照;在青岛崂山海区全生态养殖18个月,三元杂交组已达商品规格。上述结果表明,在二元杂交的基础上加入第三方亲本 S 制备的三元杂交皱纹盘鲍,在生长速度、夏季高水温期的存活率等方面都较皱纹盘鲍“中-日”杂交子代显著提高。     

皱纹盘鲍胚后消化系统发育的研究

以组织学、组织化学和透射电镜观察等方法研究了皱纹盘鲍自孵化后的担轮幼虫至1a龄幼鲍10个时期消化系统的胚后发育.食道于面盘幼虫早期出现;自围口壳幼虫食道中段的上皮细胞开始分泌蛋白酶;在上足分化幼体食道侧囊形成;在稚鲍,食道侧囊上皮分化成微绒毛细胞、分泌细胞和纤毛细胞.嗉囊直至稚鲍期才形成;在1a龄幼鲍,嗉囊腔大于胃腔.胃出现于面盘幼虫早期;到匍匐幼虫,胃腔出现单细胞藻.肠出现于面盘幼虫早期;在上足分化幼虫,肠上皮分化为纤毛细胞和微绒毛细胞两种细胞;在稚鲍肠上皮分化成纤毛细胞、微绒毛细胞、Ⅰ型腺细胞、Ⅱ型腺细胞和黏液细胞共5种细胞,肠沟出现.唾液腺形成于上足分化幼虫期.消化腺于面盘幼虫早期出现,自面盘幼虫中期开始分化成嗜碱性细胞和消化细胞.嗜碱性细胞的细胞质由嗜酸性逐渐转变为嗜碱性;至上足分化幼虫,细胞内出现含铁的折光小体.消化细胞自匍匐幼虫摄食起就出现内吞作用,细胞内含大量囊泡.研究表明,发育到稚鲍时,消化系统诸器官的结构和功能已基本接近成鲍.     

温度与盐度对壳金长牡蛎面盘幼虫生长和存活的影响

本文采用单因子分析方法研究了不同温度和盐度对壳金长牡蛎幼虫生长和存活的影响。在实验条件下,分别设置5个不同盐度(20、25、30、35和40)和4个不同温度(20、25、30和35℃),定期测量壳金长牡蛎面盘幼虫的壳高和存活率,采用单因子分析法进行数据分析。温度实验表明,高温条件(30~35℃)下,幼虫死亡率较高,适宜幼虫存活的温度为20~25℃;升温能促进幼虫的生长,适宜幼虫快速生长的温度为25~35℃;均衡生长和存活两个指标,最适幼虫人工培育的温度为25℃。盐度实验表明,高盐对幼虫的生长和存活有明显的抑制作用,适宜幼虫存活和生长的盐度均为20~30;均衡生长和存活两个指标,最适合幼虫人工培育的盐度为25。研究结果表明,壳金长牡蛎苗种培育的适宜水温为25℃,适宜盐度为25。本研究结果将为壳金长牡蛎的大规模人工繁育和养殖推广提供基础资料。