单条固定线虫基因组DNA提取及18S rRNA基因PCR扩增

根据线虫18S核糖体RM基因PCB扩增效果比较了丙酮、乙醇、乙醇 0．05mol／L FDTA(pH8．0)和5％海水福尔马林4种固定剂,碱裂解和蛋白酶K处理2种单条线虫基因组DNA提取方法的优劣。用乙醇固定的样品最适合制备RR模板DNA,而5％海水福尔马林固定的样品能最完整地保持样品形态。蛋白酶K处理获得的DNA较碱裂解获得的更适合PCR扩增。结果有助于分子生物学方法在海洋线虫分类、多样性和生态学研究中的应用。     

海湾扇贝样品不同保存条件下DNA的提取及RAPD扩增比较

以海湾扇贝为材料，研究了鲜活样品以及采用冷冻保存、70％乙醇固定和10％福尔马林固定等方法保存的闭壳肌样品用于DNA提取的不同效果，并分析了不同保存条件下所提得DNA用于RAPD扩增的结果，研究表明，鲜活样品以及采肜冷冻保存和70％乙醇固定的样品可以得到很好的DNA，其质量和得率没有显著差异，利用上述DNA模板进行RAPD分析，可以获得一致性很好的扩增结果。10％福尔马林休固定样品则没有得到可用的DNA模板。采用70％乙醇固定保存海洋生物组织，是用于DNA提取及相关的分子生物学研究的快速、简易和有效的方法。     

黄海潮间带和浅海表层沉积物中植物DNA提取和PCR扩增的方法学探索

海洋沉积物中的植物信息具有重要的生态学和古环境意义,但传统方法只能通过研究沉积物中的孢粉获取植物信息。随着分子生物学的进步,探索利用海洋沉积物中的植物分子多样性解释全球变化成为了一种新的尝试。文章首次尝试了对海洋沉积物中的植物DNA进行提取与PCR扩增,通过使用不同的DNA提取方法(DNA提取试剂盒)和PCR扩增条件[2倍浓缩的PCR扩增预混合溶液(Mix)退火温度、循环数、DNA模板量以及引物],探索海洋沉积物中植物DNA提取和PCR扩增的方法,并在采自黄海潮间带以及浅海表层的沉积物中进行了检验。共尝试了32种方法,结果表明:强力土壤微生物DNA提取试剂盒(DNeasy PowerSoil)以及2×TransTaq HiFi PCR SuperMixⅠ是较好的DNA提取与扩增条件;对于潮间带表层沉积物样品,最佳退火温度为55°C,最佳循环数为55个循环;而对于浅海表层沉积物样品,最佳退火温度为59°C,最佳循环数为45个循环;此外,相对于rbcL引物, gh引物的扩增结果更好。这项研究首次成功提取并扩增了海洋沉积物中的植物DNA,以期应用于海洋沉积物中植物分子多样性的分析,为研究全球...     

用于单一藻细胞PCR扩增反应的样品保存方法比较

用室内培养的塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense ATHK藻株)作为实验对象,分别选择了5%福尔马林固定后常温保存、95%乙醇固定后常温保存、-20℃冷冻保存、鲁哥氏液(Lugols solution)固定后常温保存等方法,在5,15,30,60 d后对保存的样品进行单细胞PCR反应,并与新鲜样品进行比较。实验结果表明,用95%乙醇保存、-20℃冷冻保存、鲁哥氏液保存的样品在60 d后仍可扩增出目标条带,与新鲜样品没有差别,但是样品中的藻细胞形态有一些改变;而以5%福尔马林固定保存的样品只能在5 d后扩增出目标条带,但藻细胞形态比较完好。因此,对用于单细胞PCR实验的微藻样品,短期内(不多于5 d)可以采用福尔马林保存,而需要长期保存的样品,应当采用乙醇或鲁哥氏液固定,或者采用-20℃冷冻保存的方法。     

大弹涂鱼基因组DNA两种提取法的比较

采用传统的饱和酚提取法和上海生物工程公司的UN IQ-10柱式基因组DNA抽提试剂盒法对大弹涂鱼的总DNA进行了提取。琼脂糖凝胶电泳结果表明,得到的DNA片段分子量在21 kb以上;通过PCR扩增实验,证明了用两种方法提取的DNA均可直接用于随机扩增的DNA多态性(RAPD)遗传标记;试剂盒法具有简单、快速、高效的优点,是一种值得推荐的DNA提取方法。     

用于单-藻细胞PCR扩增反应的样品保存方法比较

用室内培养的塔玛亚历山大藻（Alezandrium tamarense ATHK藻株）作为实验对象，分别选择了5％福尔马林固定后常温保存、95％乙醇固定后常温保存、-20℃冷冻保存、鲁哥氏液（Lugol’s solution）固定后常温保存等方法，在5，15，30，60d后对保存的样品进行单细胞PCR反应，并与新鲜样品进行比较。实验结果表明，用95％乙醇保存、-20℃冷冻保存、鲁哥氏液保存的样品在60d后仍可扩增出目标条带，与新鲜样品没有差别，但是样品中的藻细胞形态有一些改变；而以5％福尔马林固定保存的样品只能在5d后扩增出目标条带，但藻细胞形态比较完好。因此，对用于单细胞PCR实验的微藻样品，短期内（不多于5d）可以采用福尔马林保存，而需要长期保存的样品，应当采用乙醇或鲁哥氏液固定，或者采用-20℃冷冻保存的方法。     

不同提取缓冲液对红树林土壤DNA提取品质的影响

针对1种典型的酸性、高有机质含量类型土壤-红树林土壤,从DNA产量、DNA纯度、土壤腐殖酸类物质的提取量以及DNA提取物PCR(polymerase chain reaction)扩增反应的敏感度等方面比较了不同提取缓冲液对土壤DNA品质的影响.结果表明,酸性SDS(sodium dodecyl sulfate)提取缓冲液所获得的土壤DNA产量及纯度均较低;PVP (polyvinylpyrrolidone)提取缓冲液所获得的土壤DNA产量较高,但土壤腐殖酸类物质的提取量亦远高于其他提取缓冲液;酸性SDS提取缓冲液及PVP提取缓冲液所获得的土壤DNA提取物即使稀释到10-3量级亦不能获得目的基因PCR扩增条带.PVPP(polyvinylpolypyrrolidone)提取缓冲液及CTAB(cetyltrimethylammoniumbromide)+PVPP提取缓冲液所获得的土壤DNA产量较PVP提取缓冲液低,但其纯度较高,并且其纯度随提取缓冲液中PVPP浓度的升高而提高;当2%PVPP提取缓冲液及CTAB+PVPP提取缓冲液所获得的土壤DNA提取物分别稀释到10-2及10-1量级时,均能获得PCR扩增条带.综上所述,酸性提取缓冲液及PVP提取缓冲液不适用于酸性、高有机质含量类型土壤DNA的提取,而2%PVPP提取缓冲液及CTAB+PVPP提取缓冲液均能提高此类土壤DNA的提取品质.     

不同保存条件下中华哲水蚤基因组DNA提取的比较

以采自厦门港的中华哲水蚤(Calanus sinicus)为对象，研究多种保存条件对中华哲水蚤基因组DNA提取的影响。结果表明，除5％福尔马林保存的样品没有提取到DNA之外，其余样品均能成功提取出基因组DNA；以该DNA为模板通过相应引物成功扩增出线粒体DNACOI基因片段。其中无水乙醇保存样品提取可靠的基因组DNA方法的建立，为野外样品保存工作提供了一个简便，经济的途径。     

不同保存方法的大黄鱼肌肉样品基因组DNA提取及RAPD分析

以－20℃冷藏、70％（V／V）乙醇、含50mmol/dm^3 EDTA的70％（V／V）乙醇和10％（V／V）福尔马林保存等方法处理大黄鱼肌肉样品，进行了DNA的提取及RAPD分析，并与新鲜样品作了对照。实验结果表明，鲜活样品以及冷冻保存、70％（V／V）乙醇以及含50mmol/dm^3EDTA的70％（V／V）乙醇保存的样品均可得到高质量的DNA，大小在21kbp左右，含量为100μm/cm^3左右。而从10％（V／V）福尔马林保存样品也能提到DNA，但其DNA得率低，约10μg/cm^3。分别以上述提取的DNA为模板进行RAPD扩增，未见有明显的差异。     

海绵动物保存及DNA提取方法的研究

海绵标本长期、完整的保存是开展海绵分类学及分子进化研究的重要前提, 本研究以建立通用的海绵动物标本的保存方法及快速、完整的基因组DNA 提取方法为主要目的, 通过对硅质的山海绵(Mycale sp.)和钙质的白枝海绵(Leucosoleniidae sp.)为材料进行–20℃冰冻、乙醇固定、冰冻后风干和乙醇固定后风干等4 种保存方法进行研究, 同时采用酚-氯仿法、高盐法、CTAB 法等3 种基因组DNA提取方法, 测试了4 种保存方法的DNA 提取效率。实验结果显示, 海绵样品的4 种保存方法以及3 种DNA 提取方法对于硅质海绵以及钙质海绵虽然在提取的DNA 得率上有差异, 但都能获得较高纯度基因组DNA。从经济成本、方便性、潜在的污染等因素考虑, 高盐法是首选的提取海绵基因组DNA 的方法; 乙醇固定保存的海绵样品DNA 得率最高, 冰冻的海绵样品得率最低, 推荐采用乙醇固定保存海绵样品的方法。     

一种共生藻PCR模板DNA的快速制备法

采用Chelex-100树脂法制备了26个物种(分别属于腔肠动物门、海绵动物门和软体动物门)的共生藻以及一株纯培养共生藻的DNA样品。通过PCR扩增叶绿体23S rRNA基因片段获得了26个有效序列,测序比对结果显示获得的序列与扩增目的基因相符。该方法不仅样品消耗量小、操作时间短、设备需求低廉,而且可以避免使用有害化学试剂。这是一种高效、环保的DNA提取方法,可为共生藻分子研究提供技术参考。     

几种海水贝类甲醛浸渍标本DNA的提取及rRNA基因ITS序列的扩增

从中国科学院海洋生物标本馆收藏的8种甲醛浸渍的海水贝类标本中提取DNA并对其rRNA编码基因的ITS序列进行特异性扩增,在牡蛎Crassostrea sp．、长肋日月贝Amussium pleurondectes (Linnaeus)、扇贝Volachlamys ringaporinug(Sowerby)与华贵栉孔扇贝Chlamys nobilis(Reeve)等4个物种的标本中成功获得扩增产物。利用图片分析软什得出牡蛎标本的ITS-1和ITS-2扩增片段分别为408bp和524bp,长肋日月贝标本分别521bp和537bp,而扇贝Volachlamys ringaporinug(Sowerby)与华贵栉孔扇贝标本只获得ITS-1扩增片段,长度均为545bp。     

Non-destructive sampling of juvenile abalone using epipodial tentacles and mucus: method and application

Good-quality biological material is needed to obtain intact deoxyribonucleic acid (DNA) for use in molecular techniques such as the polymerase chain reaction (PCR). Non-destructive sampling protocols of juvenile abalone Haliotis midae (7–15 months old) were tested in order to collect material for DNA extraction. DNA was successfully extracted from epipodial tentacles and mucus samples. PCR results confirmed the good quality of the DNA and the reliability of the method.     

Recommendations for the processing and storage of water samples before polymerase chain reaction (PCR) analysis

A range of options for the storage and partial processing of water samples before polymerase chain reaction (PCR) analysis were evaluated. In addition, temporal storage of extracted DNA at 4 °C was investigated. Filtering the water sample and then storing that filter at ?20 °C for up to six months before DNA extraction was equivalent to extracting DNA immediately. Freezing a water sample resulted in an immediate 1 log loss of PCR signal, although thereafter the sample was stable for at least three months. A rapid loss of detectable PCR product was found when storing a water sample at 4 °C for longer than one week. Extracted DNA could be stored at 4 °C for at least six months without considerable loss of PCR signal.     

DNA/RNA提取及处理方法对评价沉积物中纤毛虫分子多样性的影响

环境DNA（eDNA）技术结合高通量测序已广泛应用于评价微型生物多样性与群落构成。相较于eDNA,RNA在环境中易降解,环境RNA（eRNA）可更准确地反映群落近期生命活性状态。理论上,基于eRNA检获的生物多样性要低于eDNA检获的总体多样性。但前期已发表研究显示同一站点eDNA获得的多样性低于eRNA检获量,推测可能原因包括：1）样本量不同;2）RNA中存在DNA污染。为验证假设,本研究以陆架区两个站位沉积物中的纤毛虫为实验对象,系统性比较四种DNA/RNA提取方法：DNA直接提取（0.9g沉积物）,大样本量DNA直接提取（2g）,DNA洗脱法（2g）,RNA直接提取法（2g）;以及三种RNA提取后的处理方法：无DNA酶反转录,含DNA酶反转录,先纯化RNA再反转录。研究结果表明,大样本量（2g）DNA直接提取法所检获的可操作分类单元（OTUs）约为小样本量（0.9g）的两倍。相同样本量下,DNA洗脱法检获的OTUs最多,而DNA直接提取检获的OTUs低于有/无DNA酶反转检获的数量,先纯化再反转录所获得OTUs最少。就群落构成而言,DNA洗脱法和RNA纯化可有效降低浮游类群比例,可更真实展现底栖群落的构成。综上,建议使用DNA洗脱法评价沉积物中微型生物的总体多样性;采用eRNA研究具有生命活性的生物群落时,反转录之前可纯化RNA,以获得更加准确的具有生命活性的群落信息。     

Comparative studies on analytical methods for the assessment of petroleum contamination in the marine environment II. Gas chromatographic analyses

Although determinations of hydrocarbons in the marine environment are usually based on the same analytical steps, i.e. organic solvent extraction, column chromatographic purification, and hydrocarbon detection and identification; variations in equipment and solvent systems used in the extraction step, and also in the columns for purification and analysis, seriously impaired the development of a consistent data base concerning oil pollution on a global scale.Many authors and conferences emphasized the need, in this field, for a comparative study on the efficiency of various published analytical techniques.Fifteen techniques with 24 applications were chosen and applied to a fixed weight of uniform samples of sediments, mussels, fish, shrimps and green algae. The final hydrocarbon extracts were analyzed individually on a 2 m stainless-steel packed column (SE 30).The results obtained from this work showed considerable variations in the efficiency of different techniques from identical samples. The hydrocarbon yields varied from 94 to 1.4 ppm in sediments, from 40 to 9 ppm in mussels; from 216 to 1.3 ppm in fish; from 8.3 to 3.1 ppm in shrimps; and from 343 to 273 ppm in algae, all relative to wet weight of the samples. The gas chromatograms of the hydrocarbons obtained were found to be quite different with regard to peak intensities and distributions. This means that hydrocarbons obtained by the application of different techniques varied in their compositions and relative concentrations of their constituents. These results confirm what was already obtained and discussed previously using spectrofluorometric analyses.It can be concluded that it is necessary to establish a standard technique for the preparation of marine samples, for extraction and purification of the hydrocarbon extracts which should be applied by all laboratories specializing in this field.