皱纹盘鲍(Haliotis discushannai Ino)胚胎RNA分离和cDNA文库构建

从皱纹盘鲍胚胎样本中分离RNA并构建了cDNA文库。分别收集孵化8、10和12h的皱纹盘鲍胚胎,用抽滤除菌的海水反复悬浮胚胎,将这3个发育阶段的胚胎样本等量混合后用TRIZOL试剂提取总RNA,将提取物用酚氯仿异戊醇再抽提2次,分离获得高质量的总RNA。从总RNA中分离mRNA,构建了皱纹盘鲍混合胚胎的cDNA文库,未扩增胚胎文库的滴度为5.0×106pfu/ml,重组率为94.12%,插入片段均大于400bp,70.6%克隆的插入片段分布在1000—1500bp之间,扩增后的文库滴度为3.06×109pfu/ml。     

南极冰藻 Chlamydomonas sp.ICE-L的 cDNA文库构建及品质检测

为构建南极冰藻Chlamydomonassp.ICE-L的cDNA文库,提取对数生长期南极冰藻ICE-L的总RNA,以此为模板,通过PowerScript逆转录酶逆转录合成第一链cDNA;再以第一链cDNA产物为模板,用LD-PCR合成第二链cDNA。该cDNA产物经分级分离转入大肠杆菌中,即获得南极冰藻ICE-L的cDNA原始文库,其滴度为1.6×106cfu/mL。扩增后的cDNA文库的滴度为1.0×1010cfu/mL。用PCR方法测得文库的重组率大于97%,插入cDNA的长度为0.5~1.8 kb,0.9 kb以上插入片段占50%以上。取适量扩增文库稀释并铺平板,挑取72个独立菌落,对其中22个独立菌落所插入的cDNA进行测序,克隆到了一个具有5′和3′非编码区的40S ribosomalprotein S5全长基因序列,GenBank收录号为AM167929。     

刺参肌肉组织cDNA文库的构建

用RNA提取试剂--TRIZOL Reagent提取刺参(Apostichopus japonicus)肌肉组织总RNA,用SMART cDNA Library Construction Kit构建cDNA文库.经测定原始文库滴度达到 3.2×10~6,扩增后文库滴度达到 5.1×10~9,重组率达到96.7%,从扩增文库随机挑取12 个克隆进行PCR 扩增鉴定,结果显示,插入片段大小为0.5～2.5 kb.通过各项指标验证成功构建了刺参肌肉组织cDNA 文库.     

副溶血弧菌感染的九孔鲍血细胞均一化全长cDNA文库的构建

采用Trizol试剂提取副溶血弧菌感染的九孔鲍血细胞的总RNA,经Oligotex纯化得到mRNA.根据SMART技术原理合成双链cDNA.双链cDNA采用双链特异核酸酶进行cDNA的均一化,构建成九孔鲍血细胞的均一化全长cDNA文库.原始文库的库容为3.4×106 cfu/cm3,重组率为92.3%,扩增后文库的滴度为2.6×1011 cfu/cm3以上.从文库中随机挑取897个克隆,测序获得高质量ESTs814条,其中有23条Contigs; 762条Singlets,Unigenes共785条,冗余率只有3.56%.以上结果说明所构建的文库质量好,完全可以满足后续基因克隆和表达序列标签测序工作的需要.     

大叶藻全长cDNA文库的构建

以3种不同盐度处理的大叶藻为材料,采用RNA转录本5’末端转换机制(SMART)构建了大叶藻叶片全长cDNA文库,原始文库滴度为8.675×106pfu/mL,重组率为97.19%,插入片段平均长度大于800bp,扩增后的文库滴度达到1.03×109pfu/mL。将部分原始λ噬菌体cDNA文库转化成质粒cDNA文库,PCR检测结果显示文库插入片段集中在750～2000bp之间。随机选取20个单克隆进行测序,其中13条序列包含完整的开放阅读框。结果表明所构建文库容量大,全长比例高,为深入开展大叶藻功能基因研究奠定了基础。     

文昌鱼头部cDNA文库的构建

采用cDNA合成技术制备文昌鱼头部cDNA基因文库.以mRNA为模板,用NotI primer-Adaptor为引物,在反转录酶的作用下,合成第一链cDNA,进而合成第二链cDNA.含有EcoRI和NotI粘性末端的双链cDNA在T4DNA连接酶作用下与λgt11 EcoRI/NotI臂相连,包装蛋白包装,得到噬菌体颗粒,即原始的文昌鱼头部cDNA文库.经X-Gal/IPTG板测定, 该文库滴度为7.8×105 pfu/cm3,重组率为70%.cDNA文库可直接应用于目的基因筛选.     

泥蚶(Tegillarca granosa) cDNA 文库的构建及铁结合蛋白基因(Ferritin)序列分析

取正常泥蚶肌肉组织获得总RNA，纯化mRNA后，利用含SfiⅠ酶切位点的CDSⅢ引物逆转录合成cDNA第一链，通过LD—PCR合成cDNA双链，经胶回收除去短片段，与pDNR—LIB载体进行连接，电转化到大肠杆菌DH10B中，构建形成原始文库，进行滴度测试和重组率鉴定。结果表明原始文库的滴度为3．17×10^5cfu／ml，重组率为86．3％，插入片段多在500--2500bp间。随机挑选458个克隆测序，经分析获得94种已知基因及87种未知基因。其中包括铁结合蛋白（Ferritin）的全长cDNA序列。该基因序列全长895bp，5’-端非编码区为163bp，3’-非编码区为213bp，开放阅读框为519bp，编码172个氨基酸。推测其蛋白分子量和等电点分别为20kDa和4．89。氨基酸序列与皱纹盘鲍、太平洋牡蛎、血红扇头蜱、文昌鱼、中华蟾蜍、非洲爪蟾、小家鼠以及人等的同源性有62％-82％。比对结果表明，铁结合蛋白基因在动物进化中高度保守。     

皱纹盘鲍群体选育第四代成鲍4种多糖裂解酶基因表达的初步研究

根据已发表c DNA序列设计引物扩增了2龄皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)的褐藻酸酶、海带淀粉酶、α-淀粉酶和纤维素酶基因片段并测定其序列,同时用半定量反转录PCR和实时荧光定量PCR技术分析了它们在不同组织中的表达。结果表明:以cDNA为模板的PCR产物序列与已发表的相应基因序列一致;以DNA为模板扩增的a-淀粉酶和纤维素酶基因片段分别含438 bp和667 bp的内含子;在纤维素酶基因片段的外显子和内含子区各检测到2个SNP;4种多糖裂解酶基因均主要在消化腺中表达,褐藻酸酶基因的表达最强,其次为纤维素酶,表明在摄食海带的条件下,褐藻酸是成体皱纹盘鲍可利用的最重要多糖类物质之一。本文的结果为进一步开展皱纹盘鲍"97"选育群体在不同发育期、摄食不同藻类及不同培育环境下的多糖水解酶基因表达研究奠定了基础。     

雨生红球藻cDNA表达文库的构建与初步分析

为了筛选雨生红球藻虾青素合成过程中的关键酶基因的反式调节因子基因,以雨生红球藻的绿细胞为材料,提取了高质量的总RNA,并分离纯化了mRNA,经过反转录后的得到cDNA,构建了以λ-ZAPExpress为载体的表达型cDNA文库。经检测,所构建的文库的滴度为5.1×105,重组率为100%。用PCR方法对文库的质量进行了鉴定,文库的平均插入片断的大小为1.7kb。雨生红球藻cDNA表达文库的构建为研究虾青素的代谢工程奠定了基础。     

3种鲍16S rRNA基因片段序列的初步研究

本文对引自日本的盘鲍 (H aliotisdiscusdiscus)、皱纹盘鲍 (H.discushannai)和大鲍 (H.gi-gantiea) 3个自然群体的线粒体 DNA 1 6S r RNA基因片段进行了扩增和测序 ,分析了 52 8bp的碱基序列 ,结果显示 :3种鲍的基因序列中 A+T含量为 56.74%～ 57.1 2 %。 3个自然群体间碱基片段序列差异不显著 ,盘鲍与皱纹盘鲍、大鲍彼此均仅有 1处核苷酸检测到变异 ,皆为碱基转换 ,同源性为99.81 % ;皱纹盘鲍与大鲍有 2处碱基转换 ,同源性为 99.61 %。 1 6Sr RNA基因在鲍属内表现出很高的保守性。     

东山九孔鲍病毒病病毒的分离观察

运用电镜负染和超薄切片技术，在福建东山患病的九孔鲍的肾组织细胞，肝细胞和肠上皮细胞中可见有大小为100nm的具包囊的六角形病毒颗粒，病鲍组织匀浆后，经蔗糖分步超速离心，RNA酶及DNA酶消化去除组织内DNA，RNA后，获得纯化的病毒颗粒，又经蛋白酶K消化后得到病毒的核酸，以DNaseⅠ或RNaseA分别消化，经1%（m/n)的琼脂糖凝胶电泳证实该病毒为DNA病毒。     

杂色鲍血蓝蛋白HtH1基因第16内含子SNP密度的分析

单核苷酸多态性（SNPs）是继RFLP和SSR多态性标记之后的新一代遗传标记系统.本文采用EPIC的方法,分析了45个杂色鲍样品的血蓝蛋白HtH1基因第16内含子（H1 intron 16）的SNP数据.这45个个体分别来自日本、台湾和汕头3个不同海域的野生或养殖群体.日本群体的血蓝蛋白HtH1基因第16内含子呈现出长度多态性,共有3种不同长度,分别是1 900、780、440 bp,测序结果表明3个等位基因可以互相比对;而台湾和汕头杂色鲍养殖群体的均为1 900 bp.初步研究结果表明日本杂色鲍个体大约96 bp长的片段含有1个自身杂合SNP位点;台湾杂色鲍个体约133 bp含有1个自身杂合SNP位点;汕头杂色鲍个体约153 bp含有1个自身杂合SNP位点.13个台湾杂色鲍个体包含的SNP密度为约31 bp含有1个SNP;23个汕头杂色鲍个体包含的SNP密度为约21 bp含有1个SNP.这些数据表明现有的杂色鲍养殖群体包含了丰富的SNP位点,利用SNP分子标记进行高密度遗传图谱的构建是可行的.     

控制虾夷扇贝闭壳肌积累类胡萝卜素相关基因的筛查

利用抑制性差减杂交技术(Suppression subtractive hybridization,SSH)对虾夷扇贝闭壳肌积累类胡萝卜素相关基因进行筛查和分析。以虾夷扇贝橘红色闭壳肌和白色闭壳肌cDNA构建正反向差减文库,结合454测序技术在正向差减文库中测序得到2 640条序列,拼接得到50个contigs(重叠群);反向差减文库中测序得到2 496条序列,拼接得到187个contigs。经过同源性比对分析,共获得150多个差异表达基因,从中选择3种清道夫受体SRB1、SRF2和SRCR作为候选基因进行研究,对其在虾夷扇贝各组织中的表达量水平进行检测,初步阐述了其在虾夷扇贝中的组织表达规律。根据结果推测在虾夷扇贝橘红色闭壳肌中,清道夫受体有可能是调节类胡萝卜素累积和转运的关键基因。本研究为虾夷扇贝闭壳肌类胡萝卜素累积相关通路的探索提供了初步研究的基础数据。     

皱纹盘鲍肝、肾表达序列标签及神经肽Y(NPY)受体基因的克隆与分析

通过构建皱纹盘鲍(Haliotis discus Hannai)cDNA文库并进行大规模测序,获得了1282条高质量的ESTs序列,对这些序列进行拼接,获得了包括650条序列在内的244组片段重叠群(Contigs)和632个单一序列(Singletons).使用BlastX软件对876个Unigenes(Uniger...     

Ovo-testis and disturbed reproductive cycle in the giant abalone, Haliotis madaka: possible linkage with organotin contamination in a site of population decline.

Histological examination of gonads as well as chemical analysis of organotin compounds in tissues of the giant abalone, Haliotis madaka, was conducted to evaluate possible endocrine disruption and to consider the causal factors for the decline of abalone stocks in Japan. Abalone specimens were collected from two different areas, Tsushima as a reference site and Jogashima as a site representative of declining abalone populations, each month from September 1995 to November 1996. Scores were given to the development stages of reproductive cells in the ovary and testis. The degree of sexual maturation was evaluated by calculating the mean value of a histogram of these scores for the reproductive cells of each abalone. The temporal variations in degree of sexual maturation showed that female and male abalone from Tsushima matured synchronously, while those from Jogashima did not. The observed maximum reproductive developmental score in abalone from Jogashima was much lower than that from Tsushima, because immature females were present at the former site throughout the spawing season. Approximately 20% of the abalone from Jogashima were masculinized females with an ovo-testis. The masculinization of female abalone was similar to the imposex, typically induced in other gastropod molluscs by tributyltin (TBT) and triphenyltin (TPhT) from antifouling paints. Concentrations of TBT and TPhT in the muscles of abalone from Jogashima (n = 83) of 4.9 +/- 4.4 ng/g wet wt and 6.3 +/- 6.6 ng/g wet wt, respectively, were significantly higher than those from Tsushima (n = 125) (P < 0.01) of 0.8 +/- 0.8 ng/g wet wt and 0.6 +/- 1.3 ng/g wet wt, respectively. In situ exposure of abalone from Tsushima caged near a dockyard in Jogashima for 7 months (from the immature to the mature stage) resulted in spermatogenesis in the ovary of approximately 90% of females. Endocrine disruption may be caused in the giant abalone by organotin compounds from antifouling paints, which are possibly one of the causal factors for the decline of Japanese abalone stocks.     

养鲍自污染水净化处理的初步研究

用孔石莼变异株Ulvapertusa、活性炭纤维（ACF）和二氯异氰尿酸钠（NaDDT）对养殖皱纹盘鲍HaliotisdiscushannaiIno产生的自污染水进行净化,并用于饲养幼鲍。结果表明,孔石莼变异株能有效地吸收对幼鲍生长产生影响的水化因子──氨氮、亚硝酸盐,而活性炭纤维对污水中的COD_Mn和细菌的吸附率分别达82％和99．98％,经孔石莼变异株处理后的养鲍污水与未处理的养鲍污水对幼鲍生长影响明显不同。文中同时提出了用活性炭纤维、孔石莼变异株和二氯异氰尿酸钠净化养鲍污水的循环反馈投饵养殖模式。     

Laboratory-scale evaluation of the potential of chemical containment for farmed abalone larval escapees

The sensitivity of abalone Haliotis midae larvae to low levels of toxicants was used to conduct a laboratoryscale experiment to determine the possibility of using chemical containment to prevent the escape of larvae from land-based culture systems, thereby reducing the environmental impact of farming operations. The cryoprotective agent, dimethyl sulphoxide or DMSO (Me₂SO), was used as a toxicant and embryos were exposed to increasing concentrations (0–25.60 mol l^–1) of DMSO for a period of 24 hours. Hatch-out rates of the control group (0.0% DMSO) did not differ from those obtained at 0.2% (2.56 mol l^–1) and 0.4% (5.12 mol l^–1) DMSO. An exposure level at and above 0.6% DMSO resulted in a significant decrease in the number of normal larvae. At an exposure concentration of 0.6% (7.68 mol l^–1) DMSO, 65% (SE 3.0) of the fertilised eggs hatched, compared to only 10% (SE 2.0) at a concentration of 1.0% (12.80 mol l^–1) DMSO. This study indicates the potential for use of DMSO as a form of chemical containment of abalone larvae, even at very low doses. It presents South African abalone farms with a chemical containment method that could potentially be used to prevent the unintentional escape of H. midae larvae from land-based operations.