浮游有孔虫B/Ca作为海水pH替代指标有效性的初步评估:生命效应和溶解作用

浮游有孔虫B/Ca主要受控于海水pH,可作为海水pH值的替代性指标,其在探索海洋对大气pCO2冰期旋回贡献作用的研究中广受关注。然而,利用浮游有孔虫B/Ca重建海水pH,其结果的可靠性还受到温度、[CO2-3]、溶解作用、生命效应(共生光合作用、呼吸作用和钙化作用)以及属种差异的制约。为评估生命效应和溶解作用对B/Ca指标有效性的影响,测定了西太平洋暖池MD06-3052岩心特征样品的浮游有孔虫表层种Globigerinoides ruber和次表层种Neogloboquadrina dutertrei在不同壳体粒径、不同壳体厚度下的B/Ca。结果表明,除两个层位外,G.ruber的B/Ca随壳体粒径的增大,总体上呈增高趋势,主要由钙化作用速率逐渐加快所致;而两个特例层位分别表现为B/Ca随粒径变化不大和随粒径先不变后增加,这可能是由钙化作用、呼吸作用与共生光合作用对G.ruber B/Ca影响的相反效应导致的竞争关系所致。N.dutertrei的B/Ca随壳体粒径的增大,总体呈降低趋势,呼吸作用可能是导致该趋势的主要原因。另外,同一层位相同粒径G.ruber和N.dutertrei的B/Ca也明显不同。这些相同种属不同粒径之间以及相同粒径不同种属之间B/Ca的差异综合表明生命效应通过表征的具体过程对浮游有孔虫B/Ca有重要影响。然而,同一层位、相同粒径、不同厚度的G.ruber和N.dutertrei B/Ca各自相差不大,表明溶解作用对浮游有孔虫B/Ca影响甚微。总之,从生命效应和溶解作用角度看,只要挑选优势粒径浮游有孔虫,将生命效应对其B/Ca的影响降到最低,浮游有孔虫B/Ca是有效的海水pH的替代性指标。     

单环刺螠硫醌氧化还原酶相互作用蛋白质的筛选

硫化物是沿海水域中常见的有害物质,对于多数生物来讲,其在微摩尔级水平便可导致生物体中毒。硫醌氧化还原酶(SQR)是一种谷胱甘肽还原酶家族的膜结合黄素蛋白,为硫化物氧化解毒的一种关键酶。本研究以体外原核表达并复性的单环刺螠SQR为材料,采用His-pulldown技术和SDS-PAGE分析,从单环刺螠体壁细胞裂解液中筛选出两个可能与SQR结合的蛋白质,分子质量分别为40 ku和60 ku。通过毛细管液相色谱-离子肼质谱分析,初步判断其为细胞色素P450(cytochrome P450)和腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporter),并初步探讨了其可能的功能。     

米氏凯伦藻细胞表面膜蛋白质组及其对温度变化的响应研究

米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)近年在我国福建、浙江和广东沿海经常形成赤潮,其赤潮不仅影响到海洋生态系统的稳定,也严重威胁到水产养殖以及人类生命健康安全。本论文以米氏凯伦藻为研究对象,建立了米氏凯伦藻细胞表面膜蛋白质荧光标记技术和细胞膜蛋白质提取方法,运用荧光差异凝胶电泳技术(2-DDIGE)对膜蛋白质进行了分析,并研究了米氏凯伦藻的膜蛋白质组及其对环境温度变动的响应。实验共鉴定到44个细胞表面膜蛋白,其中有效注释27个,主要为转运蛋白、HSP70蛋白家族和捕光蛋白等。米氏凯伦藻在20°C条件下的细胞生长和光合作用要明显好于16°C和12°C,但16°C和12°C条件下的差别不大,表明低温限制了米氏凯伦藻的生长。当米氏凯伦藻从12°C快速转移至16°C和20°C时,藻细胞密度和光合作用效率短时间迅速降低,但细胞很快即适应温度变化。细胞膜上的转运蛋白和光合作用蛋白在其适应温度变化中起着重要作用。     

利用多功能裂合酶CpcE/F合成非天然重组藻胆蛋白

藻胆蛋白裂合酶是催化藻胆色素与脱辅基藻胆蛋白亚基共价连接的裂合酶,在藻胆蛋白的生物合成途径中发挥着重要作用。本实验以藻蓝蛋白裂合酶Cpc E/F为研究对象,采用基因工程组合表达技术,构建了pCDFDuet-apcA-cpcE/F-hox1-pebS、pCDFDuet-pecA-cpcE/F-hox1-pebS等重组质粒,并导入大肠杆菌中,在IPTG的诱导下,成功表达得到两种非天然藻胆蛋白ApcA-PEB和PecA-PEB,这表明Cpc E/F不仅可以催化藻蓝胆素和脱辅基藻蓝蛋白的结合,还可以催化藻红胆素(PEB)与别藻蓝蛋白α-亚基(ApcA)和藻红蓝蛋白α-亚基(PecA)的结合,因此是一种多功能的裂合酶。根据重组产物的光谱特征峰分析发现,ApcA-PEB和PecA-PEB作为两种非天然存在的重组藻胆蛋白,具有与对应天然藻胆蛋白有着相近的特征吸收光谱和荧光发射峰,但同时具有明显的波长偏移并伴有色素异化现象,其光谱学性质主要由其所携带的色素基团决定。另外,荧光寿命衰减分析发现,不同脱辅基蛋白对于重组藻胆蛋白的光谱稳定性具有重要的影响。     

日本凋毛藻碳酸酐酶基因及其编码的蛋白特征

碳酸酐酶CA(EC 4.2.1.1)是含锌原子的金属蛋白酶,该酶的基本功能是催化CO₂与HCO₃-间的相互转换[1].该反应在许多生物过程中都发挥着重要的作用,例如离子交换、呼吸作用、pH稳定性、捕获CO₂和光合作用等[2~5].CA广泛分布于各种生物中,已知的CA酶根据氨基酸序列被分为-αCA,-βCA和γ-CA三种类型[5~7].这3种类型的CA酶序列间的相似性很低,被认为是由不同的途径进化而来的[7].α-型的CA酶在动物、植物、绿藻、细菌和蓝细菌中都有发现[7],在藻类中报道的α-型CA还很少.迄今为止只在衣藻中发现2种异构体,在盐藻中发现3种[8,9],在红藻中还未见报道.     

温度、光强和pH对条斑紫菜孢子体和配子体类囊体膜上光系统活性的影响

光合作用研究中,对于个体发育过程中类囊体膜蛋白结构和功能的变化所知甚少,其中的一个限制因素是能否纯化得到大量高活性的稳定且均一的膜蛋白。作者以条斑紫菜（Porphyra yezoensis）2个不同发育阶段（孢子体和配子体）作为研究对象,分离得到了孢子体和配子体的类囊体膜．在不同的温度、光强和pH下,对其类囊体膜上的光系统活性进行了研究。结果表明,孢子体和配子体的PSⅠ活性均随温度和光强的升高而呈现一个先升高后降低的趋势,在温度18℃,光强为2320lx时具有最高的PSⅠ活性。而孢子体乖配子体的PSll活性随温度和光强的变化趋势不明显,孢子体PSⅡ活性在温度18℃,光强为2320lx时最高,配子体PSⅡ活性在温度13℃,光强为2800lx时最高。孢子体PSⅠ在酸性条件下较活跃,在pH5．4时具有最高的PSⅠ活性,配子体PSⅠ在碱性条件下较活跃,PSⅠ活性在pH10．4时最高;孢子体PSⅡ活性随pH的升高呈现一个先升高后降低的趋势,配子体PSⅡ活性随pH变化趋势不明显,但都在pH8．0处活性最高。     

条斑紫菜类囊体膜蛋白质组双向电泳研究方法

以蓝绿温和胶电泳为工具,首次在国内用于条斑紫菜(Porphyra yezoensis)类囊体膜色素蛋白质复合物的研究。结果显示:(1)利用非离子型去污剂十二烷基麦芽糖苷(DM)增溶条斑紫菜类囊体膜,DM/Chla(w/w)15︰1产生的效果较好,在BN-PAGE胶中可以分离到较多较清晰的条带。(2)选取蔗糖密度层50%条带制备得到的类囊体膜样品进行第一向BN-PAGE和第二向SDS-Urea-PAGE电泳实验。第一向电泳分离出4个蛋白复合物,对第二向电泳胶上的15个蛋白点切取做质谱鉴定,检测到PSⅡ47ku,PSⅡ44ku,cytochrome f,PSⅡD2,PSⅡD1等蛋白。本实验证实了温和胶电泳与SDS电泳结合对于条斑紫菜这种原始红藻的类囊体膜研究方面应用的可行性。     

条斑紫菜类囊体膜蛋白质组双向电泳研究方法

本文以蓝绿温和胶电泳为工具,首次在国内用于条斑紫菜类囊体膜色素蛋白质复合物的研究。结果显示：（1）利用非离子型去污剂十二烷基麦芽糖苷（DM）增溶条斑紫菜类囊体膜,DM/Chla（w/w）15：1产生的效果较好,在BN-PAGE胶中可以分离到较多较清晰的条带。（2）选取蔗糖密度层50%条带制备得到的类囊体膜样品进行第一向BN-PAGE和第二向SDS-Urea-PAGE电泳实验。第一向电泳分离出4个蛋白复合物,对第二向电泳胶上的15个蛋白点切取做质谱鉴定,检测到PSⅡ 47KDa,PSⅡ 44KDa,cytochrome f ,PSⅡ D2,PSⅡ D1等蛋白。本实验证实了温和胶电泳与SDS电泳结合对于条斑紫菜这种原始红藻的类囊体膜研究方面应用的可行性。     

珊瑚虫-虫黄藻共生系统碳循环研究的若干进展

综述并分析了珊瑚虫-虫黄藻共生系统碳循环研究的进展,主要包括珊瑚共生系碳的来源、碳利用机制及其碳循环的影响因素等.其中,珊瑚共生系碳循环的主要影响因素包括物理因素(光照和温度)、化学因素(CO2分压、营养盐、污染物)和生物因素(珊瑚共生系的营养方式),这些因素通过影响珊瑚共生系的生理活动(呼吸作用、光合作用和钙化作用)来影响其碳循环.最后提出碳循环的一些研究重点:1)珊瑚虫-虫黄藻共生系统碳循环对全球气候变化的响应;2)珊瑚虫-虫黄藻共生系统碳循环影响因素的耦合研究,从细胞和分子水平开展碳循环的影响机理研究;3)采用微传感器技术和叶绿素荧光技术,并加强它们在珊瑚虫-虫黄藻共生系统碳循环中的应用;4)珊瑚共生系呼吸作用对有机碳循环影响的研究,特别是呼吸作用、光合作用及钙化作用三者之间的相互作用对珊瑚共生系内部碳循环的影响机制.     

高温胁迫下坛紫菜的数字基因表达谱研究

坛紫菜是潮间带重要的经济藻种,对高温、渗透压等逆境具有独特的调控机制。本文采用基于高通量测序的数字基因表达谱(DGE)技术研究了坛紫菜在高温胁迫下的基因表达差异,并分析其相应的响应方式;利用实时定量PCR技术对DGE部分数据进行验证;检测了其中较有代表性的应答基因hsp70的差异表达。结果显示,高温胁迫下坛紫菜中有256个unigene上调表达,以HSP、核糖体蛋白L12、延伸因子EF-Tu及部分光合作用相关基因为代表,3 820个unigene下调表达,主要为核酸、蛋白以及糖类等合成代谢相关基因。Gene Ontology分析表明,差异表达基因主要定位于质体等有膜细胞器,参与繁殖和发育过程,行使催化和连接酶活性的功能。Pathway分析显示,这些基因分布于107条pathway中。其中,下调表达基因最显著富集于mRNA监督和RNA转运途径,而上调表达基因部分富集于内质网的蛋白加工、RNA降解及光合作用途径。验证表明此次DGE结果具有较高准确性,hsp70基因对高温响应积极。综上所述,DGE结果反应出,在高温胁迫时,坛紫菜出现基础代谢减慢、合成速度下降、能量合成受阻、碳同化降低等现象,但光合作用前期未受影响,同时补救途径启动。     

条斑紫菜酵母双杂交文库的构建及PyMAPK5互作蛋白的筛选

为进一步研究条斑紫菜促分裂原活化激酶家族PyMAPK5的下游互作蛋白,理解其生物学功能,本研究通过酵母双杂交的方法进行其相互作用蛋白的筛选。提取不同温度和失水逆境胁迫下的RNA,利用Invitrogen体系构建条斑紫菜酵母双杂交cDNA文库,其库容为1.44×107CFU,重组率为91.8%。以pGBKT7-PyMAPK5为诱饵蛋白载体,利用共转化方法,从文库中筛选得到26个与PyMAPK5互作的候选蛋白。候选蛋白集中在光系统II相关蛋白、捕光蛋白、微管蛋白、ATP酶、GTP结合蛋白及假设蛋白等。微管蛋白、捕光蛋白、光系统II蛋白一对一验证结果为阳性,表明在酵母体内存在互作。本研究为阐明条斑紫菜PyMAPK5与其互作蛋白的关系及解析PyMAPK5下游作用机制奠定了基础。     

红毛菜与坛紫菜光合作用和品质的比较分析

为研究两种经济红藻红毛菜(Bangia fucscopurpurea)和坛紫菜(Pyropia haitanensis)的光合作用和品质差异,选取一株野生型红毛菜CY和一株野生型坛紫菜NSD35作为实验材料,分别测定二者在相同培养条件下的关键光合参数和营养成分指标。结果显示：红毛菜的最大电子传递速率、净光合速率、藻红蛋白含量分别比坛紫菜高29.6%、96.8%、60.5%;必需矿质元素钾、钙、镁、铁、锌的含量分别比坛紫菜高59.5%、39.5%、34.1%、86.2%、68.4%;红毛菜的必需氨基酸和风味氨基酸含量都高于坛紫菜。此外,二者的呼吸速率、最大光量子产率、叶绿素a、总糖、总蛋白和碘含量没有显著差异。研究结果表明,与坛紫菜NSD35相比,红毛菜CY的光合速率更快,矿质元素积累能力更强,必需氨基酸和风味氨基酸含量更高。研究结果有助于了解红毛菜和坛紫菜的光合作用和品质特点,为开发红毛菜种质资源提供数据参考。     

SDS-PAGE与液质联用技术分离和鉴定中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)血浆蛋白

提取中国明对虾的血浆蛋白用SDS-PAGE进行分离.将电泳条带从上到下平均切成4份,分别胶内酶解并利用液相色谱.串联质谱系统进行质谱分析.利用SEQUEST软件对NCBInr蛋白数据库进行检索,鉴定了66个中国明对虾血浆蛋白质.运用生物信息学手段,对鉴定的蛋白进行功能分类,包括转录、细胞结构和骨架、信号转导、蛋白质合成与处理、蛋白质折叠、分拣和降解、免疫功能、生长和发育、能量代谢、细胞周期、碳水化合物代谢、钙离子平衡、抗氧化剂和氨基酸和脂类代谢等.本研究丰富了中国对虾血浆蛋白质表达谱,可为进一步研究对虾免疫机制提供有力的支持.     

4 种病原弧菌外膜蛋白的提取及抗原性初步分析

利用十二烷基磺酸钠抽提并结合超速离心的方法提取了鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、河口弧菌(V.aestuarianus)、霍乱弧菌(V.cholerae)和副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)4种致病性弧菌的主要外膜蛋白,通过SDS-PAGE分析比较4种弧菌主要外膜蛋白的组分。结果表明:4株弧菌的外膜蛋白电泳图谱一般可得到5～10条蛋白带,分子量多数集中在26~40 kD和48~85 kD。对所提取的4种弧菌主要外膜蛋白进行SDS-PAGE后,分别与自制的兔抗鳗弧菌血清、抗河口弧菌血清、抗副溶血弧菌血清进行Western-blotting印迹分析。结果显示每种全菌抗血清可与相应菌的外膜蛋白部分组分发生免疫反应,并与其他3种弧菌外膜蛋白的部分组分产生交叉免疫反应,这些反应条带分子量主要集中于30~48 kD之间。本研究为进一步研究致病性弧菌外膜蛋白免疫学特性提供参考。     

基于鲎试剂生产的中国鲎血液质量监测方法研究

为了研究中国鲎血液质量的监测方法, 实验选择9只中国鲎检测其血液中铜含量、血细胞数量、血浆蛋白含量、血淋巴蛋白含量等指标, 并进行相关性分析。结果表明, 中国鲎血液中铜含量与血细胞数相关性r=0.917, 与血浆蛋白含量相关性r=0.995, 与血淋巴蛋白含量相关性r=0.983, 均呈现极显著相关性。中国鲎血液中铜含量与血细胞数的相关关系为Y₁=6.14+0.86X(R²=0.840), 与血浆蛋白含量的相关关系为Y₂=2.08+0.78X(R²=0.989), 与血淋巴蛋白含量的相关关系为Y₃=1.87+0.62X(R²=0.966)。中国鲎血液中铜含量不但能够直接反映血蓝蛋白的含量, 而且可以反映血细胞数、血浆蛋白含量、血淋巴蛋白含量。因此, 以中国鲎血液中铜含量作为监测血液质量的指标, 可以推动中国鲎可持续采血技术的发展与完善, 对中国鲎的利用与保护具有重要意义。     

Detection of Vibrio (Listonella) Anguillarum Porin Homologue Proteins and Their Source Bacteria from Coastal Seawater

The molecular distribution of dissolved proteins in seawater from coastal marine environments in Uranouchi Bay, Kochi Prefecture, is first reported in this article. Occurrence of bacteria-derived dissolved proteins and their source bacteria were examined using a probe of the antibody (anti-Omp35La) against a porin outer membrane protein (Omp35La) of the fish pathogenic bacterium Vibrio (Listonella) anguillarum. The electrophoretograms of dissolved proteins from coastal seawater showed a large number of discrete and individual proteins overlapped each other over a wide range of molecular masses indicating active processes in coastal environments in transferring proteins from organisms to the inanimate dissolved protein pool. Among the dissolved proteins, 37 kDa- and 18 kDa-proteins reacted with the Omp35La. In order to isolate the source bacteria of such dissolved proteins, bacteria from seawater and diseased fish were screened by colony Western blotting with anti-Omp35La. The reactive strains were further examined in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)/Western blotting to verify the presence of Omp35La homologues among the outer membrane proteins of such strains. Outer membrane proteins reacting with anti-Omp35La were detected in only 4 strains of the 129 strains that were positive in the colony Western blotting. The level of possible source bacteria of 37 kDa- and 18 kDa-dissolved proteins was suggested to be 5–6 orders of magnitude lower than the total bacterial count. The present study leads us to hypothesize that a minor portion of the bacterial assemblage is responsible for the dissolved proteins in the coastal waters.     

Ab initio investigations of the charge transport properties of endohedral M@C20 (M= Na and K) metallofullerenes

Using density functional theory and quantum transport calculations based on nonequilibum Green's function formalism, we investigate the charge transport properties of endohedral M@C₂₀ (M= Na and K) metallofullerenes. Our results show that the conductance of C₂₀ fullerene can be obviously improved by insertion of alkali atom at its centre. Both linear and nonlinear sections are found on the I-V curves of the Au-M@C₂₀-Au two-probe systems. The novel negative differential resistance behaviour is also observed in Na@C₂₀ molecule but not in K@C₂₀.     

Acclimatory responses to high-salt stress in Chlamydomonas (Chlorophyta, Chlorophyceae) from Antarctica

Antarctic ice microalga can survive and thrive in channels or pores containing high salinity in Antarctic ice layer. In this study, it was found that cell membrane permeability of green microalga Chlamydomonas sp. L4 from Antarctic sea ice was high in cells treated with hypersalinity due to the induction of active oxygen and radicals. However, increased super oxide dismutase (SOD) scavenged harmful free radicals effectively to keep cell membrane integrity. Also, the analysis of membrane fatty acids demonstrated the content of saturated fatty acids and monounsaturated fatty acids increased and polyunsaturated fatty acids decreased under the high-salt treatment for 14 d, which effectively reduced the membrane fluidity and minimized the injury to cell membrane. The morphological changes showed that hypersalinity induced the increase of cell volume and the consumption of starch granules. However, because of the increase in detoxification of vacuoles, electron-dense deposits and SOD activity under high-salt stress, the complete noninterference thylakoids, mitochondria and cell nucleus maintained cellular fundamental metabolism. Global-expression profiling of proteins showed eight protein spots disappeared, 18 protein spots decreased and 18 protein spots were enhanced after the high-salt shock obviously (P<0.05). One new peptide (pI 6.90; MW 51 kDa) was primarily confirmed as the processor of light reaction center protein CP43 in photosystem Ⅱ, which increased photosynthesis ability of Chlamydomonas sp. L4 treated with high salinity.     

条斑紫菜叶状体不同区域光合活性的研究

以幼嫩条斑紫菜（eorphyra yezoensisUeda）为材料,研究了叶状体基部到梢部组织的固碳率和光合活性的变化。结果表明：（1）基部到梢部不同区域组织的固碳率不同,基部区域组织固碳率明显低于其他区域,靠近梢部区域的固碳率最高;（2）基部到梢部不同区域的光合活性和叶绿素水平也不一样,基部和梢部组织的光合活性偏低...     

日本囊对虾Cathepsin L基因的鉴定及其在幼体发育中的表达研究

本研究从日本囊对虾（Marsupenaeus japonica）中获得半胱氨酸蛋白酶家族中的cathepsin L基因,命名为Mj-Cathepsin L。Mj-Cathepsin L基因cDNA序列全长1191bp,其开放阅读框编码的Cathepsin L蛋白前体包含327个氨基酸,由信号肽,蛋白前体和成熟蛋白三部分组成。同源序列比对发现日本囊对虾Cathepsin L蛋白与其他已知物种的cahtepsin L蛋白具有较高的同源性。对Mj-Cathepsin L基因在不同组织以及早期幼体幼体发育阶段的研究发现,Mj-Cathepsin L主要在肝胰腺中大量表达,且在幼体发育不同阶段,其表达水平受发育阶段调控,且Mj-Cathepsin L基因显示出与其五个蜕皮时期相关的表达变化,说明Mj-Cathepsin L有可能在日本囊对虾个体发育过程中扮演不同的重要作用。并通过Western Blot方法在日本囊对虾肝胰腺,胃和肠中检测到Cathepsin L酶原和成熟Cathepsin L两种蛋白存在形式。