不同温度下罗非鱼人工感染海豚链球菌后血液生化指标及组织病理

在28℃、33℃两种温度下,用海豚链球菌人工感染尼罗罗非鱼后,测定尼罗罗非鱼血液生化指标。结果显示:两个温度水平病鱼的血清总蛋白(TP)随时间延长都呈现升高趋势;谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性随时间延长先升高后降低再升高,33℃实验组ALT、AST活性比28℃实验组达峰值时间短,并显著高于对照组(p<0.05);尿素、钾(K+)含量随时间延长逐渐升高后降低,钠(Na+)含量先升高后降低再升高,肌酐含量呈上升趋势;血清碱性磷酸酶(AKP)活性28℃实验组呈先升高后降低趋势,33℃实验组呈升高趋势;超氧化歧化酶(SOD)活性随时间延长先升高后降低再升高,33℃实验组各个时间点基本高于28℃实验组;球蛋白(GLO)随感染后时间延长呈现升高趋势,至120 h,显著高于对照组(p<0.05),但温度组间各时间点没有显著差异(p>0.05)。组织病理学观察发现,33℃实验组肝细胞、肾小管上皮细胞水肿变性;28℃实验组肝细胞出现嗜酸性小体;肾小管上皮细胞出现嗜酸性的红色小体,颗粒变性。表明感染海豚链球菌的尼罗罗非鱼肝脏、肾脏均有损伤,造成功能障碍,高温时损伤更严重。     

无乳链球菌灭活疫苗对罗非鱼的免疫效果

制备无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)临床分离株ZJ02的灭活疫苗,采用注射和浸泡2种方法,研究疫苗对吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)的免疫保护效果和血清抗体效价。注射组以4个不同浓度的白油佐剂灭活疫苗免疫罗非鱼,浸泡组以相同免疫剂量的灭活疫苗分别与消旋山莨菪碱、脂肪醇聚氧乙烯醚和氯化钠3种佐剂免疫罗非鱼。结果显示,无乳链球菌疫苗对罗非鱼具有较强的免疫原性,与对照组相比,免疫组血清中的抗体效价水平均显著性提高(p<0.05),注射组和浸泡组的抗体效价最高分别达到1∶256和1∶128;注射组中不同剂量的疫苗免疫组免疫保护率较高,高浓度组可达到95%,浸泡组中使用3种佐剂的免疫组免疫保护率分别为59%、64%、55%。表明无乳链球菌灭活疫苗对罗非鱼具有很好的免疫保护性,免疫剂量在5×108~4×109cfu/mL之间对注射免疫效果有显著性影响,消旋山莨菪碱、脂肪醇聚氧乙烯醚和氯化钠对浸泡免疫效果具有不同的免疫保护率。     

注射黄芪多糖对吉富罗非鱼c型溶菌酶基因表达量的影响

将黄芪多糖(APS)用无菌生理盐水配制成2 mg/mL和20 mg/mL针剂,腹腔注射吉富罗非鱼,以注射无菌生理盐水为对照。24 h后分别提取吉富罗非鱼鳃、头肾、肝脏、脾脏等组织中的总RNA并反转录成cDNA,利用Real-time PCR方法对不同组织中基因表达进行定量分析。结果表明:吉富罗非鱼腹腔注射20 mg/mL高剂量APS后,其鳃、头肾、肝脏等三个组织中的Lysozyme-c基因表达量显著高于对照组(P<0.05);注射2 mg/mL低剂量APS后,Lysozyme-c基因表达量仅在脾脏中出现显著上调(P<0.05)。APS可通过诱导Lysozyme-c基因在鳃、头肾、肝脏和脾脏等组织在的表达量,来提高吉富罗非鱼的机体免疫力。     

海因类消毒剂对吉富罗非鱼的急性毒性

用溴氯海因(BCDMH)和二溴海因(DBDMH)两种消毒剂对吉富罗非鱼进行急性毒性试验,研究吉富罗非鱼对海因类消毒剂的耐受性。结果表明:溴氯海因对吉富罗非鱼苗的24 h LC50、48 h LC50和安全浓度分别为9.61、8.66、2.11 mg/L,二溴海因对吉富罗非鱼苗的24 h LC50、48 h LC50和安全浓度分别9.89、9.78、2.87 mg/L。     

珍珠囊发育中马氏珠母贝血清免疫因子的变化规律

马氏珠母贝育珠贝插核手术后的第1、第2、第3、第10、第15、第20、第30和第60天,抽取育珠贝血清,并研究其非特异性免疫因子酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和溶菌酶(LSZ)的活性变化。结果表明:在珍珠囊发育初期(插核后3～10d),育珠贝血清的免疫因子ACP、AKP、CAT、SOD均比对照组(未经插核的马氏珠母贝)显著性增大(P<0.05),LSZ在插核后1～3d比对照组LSZ活性显著性增大(P<0.05);在珍珠囊发育中期(插核后第15～20天),各种免疫酶活性都逐渐降低;珍珠囊发育后期(插核30d后),育珠贝血清中的各种免疫酶活性都已恢复到对照组水平。     

温度和盐度对吉富罗非鱼幼鱼肠道两种抗氧化酶活力的联合效应

采用中心组合设计和响应曲面法研究温度(12~34℃)和盐度(0~26)对吉富品系尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)幼鱼(体长4.20±0.10 cm,体质量2.42±0.15 g)肠道超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalane,CAT)的联合效应。结果表明:1)温度对吉富罗非鱼幼鱼肠道SOD和CAT活力的线性效应和累积效应均极显著(P<0.01);盐度对吉富罗非鱼幼鱼肠道SOD活力线性效应显著(P<0.05),累积效应极显著(P<0.01);盐度对吉富罗非鱼幼鱼肠道CAT活力线性效应不显著(P>0.05),累积效应极显著(P<0.01);温度和盐度对SOD活力的互作效应极显著(P<0.01),对CAT活力的互作效应不显著(P>0.05)。2)响应曲面法分析表明,随着温度和盐度的增大,两种抗氧化酶的活力均呈先减小后增大的趋势。3)建立两种抗氧化酶活力与温度、盐度间关系的模型方程(SOD:决定系数R2=0.992 9,预测决定系数R2Pred.=0.939 2,P<0.01;CAT:决定系数R2=0.948 5,预测决定系数R2Pred.=0.647 1,P<0.01),两模型方程可用于预测吉富罗非鱼幼鱼肠道SOD和CAT的活力。4)优化结果显示,温度为24.15℃,盐度为11.75时,SOD活力最小值为9.80 U/mg,CAT活力最小值为9.28 U/mg,满意度函数值高达0.961。     

吉富罗非鱼最适生长水温研究

为研究不同养殖水温对吉富罗非鱼摄食和生长的影响,了解吉富罗非鱼的最适生长水温,实验设计28℃、30℃、32℃、34℃4个不同温度梯度,周期45 d。结果表明:不同水温环境下吉富罗非鱼表现出不同的生长特性,养殖在30℃水体中的罗非鱼生长速度明显高于其他温度组;水温对吉富罗非鱼的特定生长率、绝对增重率、饲料转化率、摄食率有显著影响(P<0.05),之间的相关关系可以用二次回归曲线来描述,特定生长率(SGR)与水温的关系式为rSGR=-19.255+1.3794T-0.0235T2,摄食率(FR)与水温的关系式为rFR=-22.175+1.5901T-0.026 6 T2,饲料转化率(FCR)与水温的关系式为rFCR=34.041-2.2256T+0.0382 T2;吉富罗非鱼的最适生长水温为29.3℃,最大摄食率的水温为29.9℃,最高食物转化率水温为29.1℃。     

壳寡糖对吉富罗非鱼幼鱼生长性能、非特异性免疫及血液学指标的影响

用添加质量分数0.00(对照组)、0.10%、0.30%、0.50%和0.70%壳寡糖的饲料饲喂初始体重(3.81±0.23)g的吉富罗非鱼幼鱼(Oreochromis niloticus)10周,研究不同浓度壳寡糖的添加对吉富罗非鱼幼鱼的生长、非特异性免疫功能以及血脂指标的影响。结果表明:与对照组相比,在4个不同浓度添加组中,添加质量分数0.50%壳寡糖能显著提高幼鱼的增重率(P<0.05)、特定生长率(P<0.05),并降低饲料系数(P<0.05);添加质量分数0.3%和0.5%壳寡糖能显著提高幼鱼抗嗜水气单胞菌感染的能力(P<0.01);添加质量分数0.10%、0.30%、0.50%壳寡糖能显著提高幼鱼血清中碱性磷酸酶活性(P<0.05)。同时,各浓度的壳寡糖均能明显提高幼鱼血清中溶菌酶和超氧化物歧化酶活性以及抗嗜水气单胞菌感染的能力(P<0.05),并降低幼鱼血清中总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平(P<0.05)。在本实验条件下,添加壳寡糖可提高吉富罗非鱼幼鱼生长性能、饲料利用率、非特异性免疫功能和调节血脂水平,添加量以质量分数0.30%~0.50%为宜。     

水解单宁对副溶血弧菌感染凡纳滨对虾血液及血细胞免疫指标的影响

【目的】研究水解单宁饲养的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)在副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticu)胁迫24 h后的生理响应,初步探究水解单宁对凡纳滨对虾血液和血细胞的影响。【方法】在基础饲料中分别添加质量分数为0%(对照组)、0.05%、0.10%、0.15%和0.20%的水解单宁(HTs),饲喂凡纳滨对虾60 d。对对虾注射0.2 mL的副溶血弧菌(2.5×10~8 CFU·mL~(-1)),感染24 h后,分析血细胞凋亡率、活性氧含量(ROS)、一氧化氮含量(NO)、酯酶活性、Toll样受体(TLR)和热休克蛋白70(HSP70)基因的表达水平;测定血清的碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD),总抗氧化能力(T-AOC)和溶菌酶(LZM)活性。【结果】在感染副溶血弧菌24 h后,实验组对虾的血细胞凋亡率,ROS、NO水平显著低于对照组,酯酶活性显著高于对照组(P 0.05)。实验组凡纳滨对虾血清的AKP、ACP、SOD活性,T-AOC和LZM活性均显著高于对照组(P 0.05)。实验组对虾血细胞TLR和HSP70基因的表达水平显著上调(P 0.05)。【结论】饲料中添加水解单宁可提高凡纳滨对虾的非特异性免疫能力和抗氧化功能,阻止氧化损伤的发生,清除机体受到刺激产生的ROS和NO,增强酯酶活性,减少细胞凋亡,从而提高凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染的能力。     

壬基酚对罗氏沼虾血清中免疫酶活力的影响

将罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)在0.1、0.2、0.4 mg/L的壬基酚中暴露48 h,检测壬基酚对罗氏沼虾血清中部分免疫酶活力的影响。结果表明:高剂量壬基酚组(0.4 mg/L)的罗氏沼虾血清超氧化物歧化酶(SOD)活力在前期受到明显抑制(p<0.05),24 h后各剂量组血清SOD活力转为促进,中、高剂量组的SOD活力显著高于对照组(p<0.05);中、低剂量组血清中酸性磷酸酶(ACP)活力均受到抑制,其中12 h低剂量组血清ACP活力显著降低(p<0.05),高剂量组则表现为先促进后抑制的效应;各剂量组血清碱性磷酸酶(AKP)活力先受到抑制后转为促进,48 h中、低剂量组血清AKP活力显著高于对照组(p<0.05)。     

氨氮胁迫对马氏珠母贝免疫活性的影响

在实验室条件下探讨氨氮胁迫对马氏珠母贝(Pinctada martensii)血细胞密度、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、溶菌酶(LSZ)、酸性磷酸酶(ACP)活性的影响。结果表明:1)不同浓度氨氮(1.25~40 mg/L)胁迫3 d后,马氏珠母贝血细胞密度随氨氮浓度的增加呈下降趋势,当氨氮浓度超过5 mg/L时血细胞密度较对照组明显下降,差异极显著(P<0.01);2)血清SOD活性随实验氨氮浓度(1.25~40 mg/L)的增加而明显下降,在较低氨氮浓度(1.25~5 mg/L)时,SOD活性高于对照组,氨氮浓度超过10 mg/L时,SOD活性低于对照组,各实验组SOD活性与对照组均存在极显著差异(P<0.01);3)当氨氮浓度为1.25~20 mg/L时,马氏珠母贝血清CAT活性随氨氮浓度的增加而升高,除氨氮1.25 mg/L组外,其余各实验组血清CAT活性较对照组极显著升高(P<0.01),当氨氮浓度为30~40 mg/L时,血清CAT活性呈急剧下降趋势,且低于对照组(P<0.01);4)马氏珠母贝血清LSZ活性随实验氨氮浓度的增加而降低,当氨氮浓度为10 mg/L以下时,血清LSZ活性高于对照组,当氨氮浓度为20 mg/L以上时,血清LSZ活性较对照组极显著降低(P<0.01);5)氨氮浓度为1.25~10 mg/L时,马氏珠母贝血清ACP活性随氨氮浓度的增加而升高,且高于对照组(P<0.01),当氨氮浓度超高20 mg/L时,马氏珠母贝血清ACP活性随氨氮浓度的增加急剧降低,且低于对照组(P<0.01)。     

罗非鱼4个选育群体遗传结构SSR分析

采用SSR分子标记分析了吉富品系罗非鱼的两个家系(GF1和GF2)以及奥利亚罗非鱼(Fo)和奥本尼罗罗非鱼(Fn)群体的遗传结构。结果显示,扩增后等位基因数为3～8个,随引物不同而异,14对引物共扩增60个等位基因,扩增片断大小在102～267 bp之间。微卫星分析表明,奥本尼罗罗非鱼(Fn)的平均观测杂合度(0.764 3)和平均期望杂合度(0.519 6)均最高,吉富尼罗罗非鱼(GF1)平均多态信息含量(0.419 5)最高;吉富尼罗罗非鱼(GF2)平均观测杂合度(0.614 2),奥利亚罗非鱼(Fo)的平均期望观测度(0.446 6)、平均多态信息含量(0.359 2)最低;因此,吉富鱼(GF1)的遗传多样性最高,奥利亚的遗传多样性最低。Hardy-Weinberg平衡遗传偏离指数(D)奥利亚(Fo)和尼罗(Fn)(0.463 4和0.478 9)明显高于吉富的两家系(0.234 1和0.250 0)。Fo与GF2间遗传距离(0.477 0)最大;而GF1和GF2间的遗传距离(0.302 7)最小,遗传相似系数(0.607 3)最大,可推断新一代吉富罗非鱼与本地选育群体有相对较远的亲缘关系,更具杂种优势。     

高温对吉富罗非鱼幼鱼生长及超氧化物歧化酶、乳酸脱氢酶活力的影响

研究34℃高温环境下吉富品系罗非鱼(GIFT Oreochromis niloticus)幼鱼生长及超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)活力的变化规律,以及SOD、LDH活力与幼鱼生长间的关系。结果表明:持续高温对幼鱼特定生长率及SOD、LDH活力的影响有统计学意义(P<0.05);随着时间的延长,LDH活力显著提高,差异有统计学意义(P<0.05),特定生长率及SOD活力随时间变化不具统计学意义(P>0.05);LDH活力增强是高温条件下幼鱼特定生长率降低的原因之一。     

罗非鱼海豚链球菌的培养及其培养基的优化

研究了海豚链球菌(Streptococcus iniae)ZJMX04的培养与生长特性,探讨培养基的pH值、气体环境、温度等因素对海豚链球菌生长的影响,并采用正交实验法对海豚链球菌培养基生长因子添加量进行优化。结果表明,海豚链球菌培养基的最适pH为7～8,最适培养温度为30℃,振荡培养对海豚链球菌的生长影响不明显。培养基优化研究表明,在BHI培养基中添加10mg/mL的酵母粉和2mg/mL的葡萄糖即可在对数期获得最大细菌量。     

硝化细菌对罗非鱼苗培育环境及抗病力的影响

于罗非鱼鱼苗培育水体中引入不同浓度的硝化细菌,检测主要水质因子,测定罗非鱼与抗病力有关的酶的活力,研究微生态调控对水质和对罗非鱼抗病力的影响。结果显示,硝化细菌浓度为100/L时,氨氮含量相对于对照组降低25.05%,亚硝酸氮含量降低45.16%,COD值降低12.33%,差异显著(P<0.05);鱼苗培育成活率相对于对照组高7.58%,体长增加22.18%,体重增加46.15%;幼鱼的抗菌酶、碱性磷酸酶(AKP)和超氧化物歧化酶(SOD)活力相对于对照组分别提高18.60%、59.19%和49.89%,差异显著(P<0.05),组织过氧化物酶(POD)活力差异不显著。表明不同浓度的硝化细菌可显著改善罗非鱼苗培育环境的水质,增强罗非鱼苗的抗病力。     

溶藻弧菌肽聚糖和vp28-siRNA对凡纳滨对虾白斑综合征病毒的抑制作用

对感染白斑综合征病毒(WSSV)的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)分别注射0.05和0.10μg/μL的vp28-si RNA,干扰效果实验表明,si RNA最佳浓度为0.10μg/μL。凡纳滨对虾感染WSSV 24 h时注射0.10μg/μL的vp28-si RNA,检测免疫后不同时间点的干扰效果。结果表明:在注射vp28-si RNA 6 h后,实验组与对照组WSSV病毒拷贝数差异有统计学意义(P0.05);在48 h时实验组病毒拷贝数急剧下降,对照组则保持较高水平,可较好干扰WSSV病毒复制,干扰效果持续120 h,对凡纳滨对虾的保护率为40%。凡纳滨对虾用0.10 mg/m L肽聚糖(Peptidoglycan)免疫24 h后感染WSSV,检测6、12、24 h注射vp28-si RNA的保护率。结果显示:6 h注射组的保护率为80%,12 h注射组为63.33%,24 h注射组为56.67%。凡纳滨对虾在肽聚糖和vp28-si RNA作用后,可增加其对WSSV抗感染作用,降低死亡率,干扰时间越早,对对虾的保护率越高。     

注射氟苯尼考对红笛鲷免疫指标的影响

以0、5、10、20 mg.kg-1的氟苯尼考腹腔注射红笛鲷,研究氟苯尼考在国家规定的使用范围内对红笛鲷血清部分免疫指标的影响。结果显示:5 mg.kg-1组氟苯尼考对所测的各项指标无影响或影响不显著;10 mg.kg-1组中氟苯尼考对红笛鲷血清SOD活力、AKP活力有显著性提高(P<0.05),对溶菌酶的含量、IgM的含量无显著性影响;20 mg.kg-1组中红笛鲷血清碱性磷酸酶AKP、超氧化物歧化酶SOD活力、溶菌酶、抗体IgM均受到显著性抑制(P<0.05),但影响持续时间不同,这表明高浓度氟苯尼考显著抑制红笛鲷各项免疫指标,从而影响到鱼体自身的免疫功能。     

尼罗罗非鱼CD247基因克隆及其组织表达分析

【目的】克隆尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)CD247基因(Gen Bank登录号:MF975639;On-CD247),分析On-CD247的生物信息学特征及其在正常和经灭活无乳链球菌注射刺激的尼罗罗非鱼组织中的表达。【方法】设计CD247基因引物并对CD247基因片段进行扩增,运用荧光定量PCR技术分析尼罗罗非鱼CD247组织分布。【结果与结论】CD247基因编码区为453 bp,编码150个氨基酸,理论分子质量为16.9 ku,等电点为6.33,在跨膜区域有保守的ASP27、Asp35残基,胞内具有三段保守的免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。On-CD247序列与红笛鲷(Lutjanus sanguineus)相似性最高,为74.0%,与其他鱼类的相似性介于35.8%～73.0%之间。On-CD247在健康尼罗罗非鱼各组织中均有表达,其中在胸腺中表达量最高,其次是皮肤、肌肉、鳃,在头肾中表达量最低。经灭活无乳链球菌刺激后,On-CD247的表达量在胸腺、头肾和肠道中均显著上调,而在脾脏中却显著下调,且有明显的时序性。胸腺、头肾和肠道均在3 h表达量最高,脾脏在12 h表达量最低,头肾中的表达量也在12 h回落,表明On-CD247表达可被无乳链球菌所诱导。     

广东省罗非鱼主养区无乳链球菌的分离、鉴定与致病性

从广东省5个罗非鱼主养区患暴发性的罗非鱼中分离到15株菌,挑选其中的5株(不同地域、不同组织分离的菌株)进行人工感染试验,表现出自然发病的症状,确定此5株分离菌为导致罗非鱼暴发病的主要病原。通过形态学观察和生理生化实验,并结合16SrRNA基因序列分析,5株分离菌株均为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。5株分离菌在形态学和生理生化实验结果上保持一致,16SrRNA基因序列同源性达98.6%～99.8%,但在致病性和对药物的敏感性上却呈现一定的差异。另外10株分离菌株通过生理生化实验鉴定也为无乳链球菌。研究表明,广东省罗非鱼流行性暴发病的病原菌主要为无乳链球菌。     

尼罗罗非鱼干扰素调节因子4基因的克隆与表达

【目的】探究干扰素调节因子(IRF)在尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)免疫中的作用。【方法】从尼罗罗非鱼中鉴定IRF4同源物,命名为OnIRF4。使用生物信息学分析软件分析OnIRF4的氨基酸序列。对健康尼罗罗非鱼腹腔注射浓度为3×10~7 CFU/mL的无乳链球菌200μL,用实时荧光定量PCR法分析OnIRF4在健康鱼中的表达模式及其对细菌感染的生物学效应。【结果与结论】OnIRF4序列的开放阅读框为1 350 bp,编码449个氨基酸。OnIRF4与其他物种的IRF4蛋白的同源性为52%～98%。推导的OnIRF4肽链具有干扰素因子典型的DNA结合结构域(DBD)、干扰素相联结构域(IAD)。亚细胞定位结果表明,OnIRF4主要定位在细胞核。表达分析表明,OnIRF4在健康尼罗罗非鱼皮肤、头肾、鳃、脑、肠、肌肉、肝、胸腺和脾中均有分布。在无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)感染后,OnIRF4在肝脏、脾脏、头肾、脑中的表达显著上调(P0.05),表明OnIRF4参与了尼罗罗非鱼对细菌感染的免疫反应。