应用单克隆抗体检测牙鲆血清中抗淋巴囊肿病毒的特异性抗体

应用杂交瘤单克隆抗体技术制备10株分泌抗牙鲆免疫球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。利用单抗2H4,通过间接酶联免疫法(ELISA)对牙鲆血清中抗淋巴囊肿病毒(LCDV)特异性抗体进行了检测。结果表明:无外观症状的牙鲆血清中特异性抗体水平很低(平均OD值为0.092),个别鱼体偏高,证明已感染LCDV,处于潜伏期;患淋巴囊肿病且症状显现的牙鲆血清中特异性抗体水平升高(平均OD值为0.165),患淋巴囊肿病后处于恢复期的牙鲆抗体水平最高(平均OD值为0.231);健康牙鲆接种LCDV灭活疫苗后,特异性抗体水平显著升高。     

应用FG细胞检测淋巴囊肿病毒中和抗体方法的建立

将提纯的淋巴囊肿病毒(LCDV)接种于牙鲆鳃细胞系(FG),可以观察到明显的细胞病变,半数细胞培养物感染量(TCID50)为22.88/40 μL.微量细胞病变中和实验显示患淋巴囊肿病的牙鲆血清以及通过免疫获得的兔抗LCDV血清对LCDV感染都具有明显的中和作用,具有中和效果的血清最高稀释度分别为1:64和1:160.本文建立的FG细胞检测LCDV中和抗体方法可以作为筛选LCDV中和抗体的有效途径,且重复性和稳定性较好.     

免疫细胞化学法测定鱼类淋巴囊肿病毒(LCDV)滴度

利用免疫细胞化学法测定鱼类淋巴囊肿病毒(LCDV)滴度.以牙鲆鳃细胞系(FG)作为感染细胞,将生长旺盛的FG细胞接种于48孔培养板中培养至形成细胞单层,用2倍连续稀释的LCDV粗提液分别接种FG细胞.固定各稀释度LCDV感染后的FG细胞,孵育抗牙鲆LCDV单克隆抗体,其后再运用生物素-亲合素反应系统,以碱性磷酸酶底物APRed试剂盒发色.倒置显微镜观察,被病毒感染的FG细胞的细胞质呈现红色,未被感染细胞的细胞质呈无色.记录各稀释度病毒感染的阳性细胞孔数,按Reed-Muench法计算组织细胞培养半数感染量(TCID0).结果显示,免疫细胞化学法测得LCDV在FG的滴度为1.77×210 TCID50/mL.该法可以用来有效测定LCDV滴度,且结果直观、准确性较好,灵敏度较高.     

牙鲆淋巴囊肿病毒靶器官上病毒结合蛋白的鉴定

利用抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的间接免疫荧光检测技术,在患淋巴囊肿病牙鲆的表皮、鳃、胃、肠及肾中发现淋巴囊肿病毒的感染,以此确定为病毒感染的主要靶器官。用NP-40细胞裂解液分别抽提靶器官的总蛋白,利用病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)对靶器官上淋巴囊肿病毒结合蛋白进行鉴定,结果显示在胃、肠及肾的组织蛋白中均有1个分子量为27.8 kDa的蛋白与淋巴囊肿病毒特异结合,在鳃和表皮的组织蛋白中分别存在分子量为37.6 kDa和56.0 kDa的蛋白与淋巴囊肿病毒特异结合。推测在淋巴囊肿病毒靶器官上的这3种病毒结合蛋白有可能是病毒的受体蛋白。     

日本刺参的抗肿瘤及免疫调节作用研究

采用日本刺参（Apostichopus japonicus）浆灌胃移植性肿瘤模型小鼠，探讨了日本刺参的抗肿瘤作用及其对免疫功能的调节作用。结果表明，日本刺参各剂量组均能显著抑制小鼠S180肉瘤的生长，提高小鼠脾指数及胸腺指数（P〈0．05）；显著提高荷瘤小鼠血清溶血素含量（P〈0．01）和抗体形成细胞数（P〈0．05）；提高迟发型变态反应水平和脾淋巴细胞转化能力（P〈0．05，P〈0．01）；促进NK细胞活性和巨噬细胞的吞噬能力（P〈0．05。P〈0．01）。提示日本刺参能全面调节机体的特异性和非特异性免疫功能．控制和杀灭肿瘤细胞。     

盐度对牙鲆非特异性免疫功能的影响

实验以健康牙鲆成鱼为研究对象，分别饲养于盐度为40，30(对照组)，20的海水中，以牙鲆血清的凝血活性、溶菌酶含量以及补体因子C3含量为指标，研究盐度对牙鲆非特异性免疫功能的影响。结果表明，盐度增加或降低3d后血清凝血活性升高4倍，并一直保持至12d不变；溶菌酶含量先是升高，在第5天达到高峰后又逐渐降低，至第12天的含量反而略低于对照组；C3的含量在第一天取样时就比对照组有了很大的增长，随后逐渐下降，在第7天后恢复正常。盐度变化导致牙鲆非特异性免疫因子变化，说明在养殖生产中维持稳定环境极为重要。     

基于rGroEL和rOmpC的牙鲆迟缓爱德华氏菌血清学诊断试纸条的制备

本实验旨在制备一种基于重组抗原rGroEL和rOmpC的迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)血清学诊断试纸条,用于定性检测牙鲆(Paralichthys olivaceus)血清中抗迟缓爱德华氏菌的抗体水平。前期研究发现分子伴侣蛋白GroEL和外膜蛋白OmpC是迟缓爱德华氏菌的重要免疫保护性抗原。本研究重组表达获得高纯度的rGRoEL和rOmpC,以其免疫健康牙鲆制备抗血清,同时制备获得牙鲆抗迟缓爱德华氏菌全菌血清。ELISA结果显示rGroEL和rOmpC不存在抗原交叉,抗rGroEL和rOmpC血清均可与全菌发生阳性结合,且全菌抗血清也能识别rGroEL和rOmpC。将rOmpC、rGroEL及羊抗鼠IgG划线于NC膜分别作为检测线T1、检测线T2和质控线C,同时以制备的胶体金标记的鼠抗牙鲆IgM单克隆抗体2D8固定于结合垫,构建获得胶体金免疫层析试纸条。将试纸条分别用以检测不同稀释度的各抗血清,检测过程可在15min内完成,结果显示制备的灭活全菌、rGroEL和rOmpC牙鲆抗血清分别最高稀释200、600与400倍时,均可使检测线T1与T2显红色。同时,以试纸条检测牙鲆免疫全菌灭活疫苗后不同时间点的抗血清,结果显示3、4、5周检测结果为阳性,且检测线颜色随着免疫后时间延长而加深。实验结果表明,制备的基于重组抗原rGroEL和rOmpC迟缓爱德华氏菌血清学诊断试纸条,操作简单,结果快速可见,可以定性检测牙鲆血清中抗迟缓爱德华氏菌的抗体水平,可应用于全菌灭活疫苗、rGroEL和rOmpC亚单位疫苗免疫效果的评价,同时也具有牙鲆爱德华氏菌病的潜在诊断价值。     

解郁降压颗粒结合音乐疗法对围绝经期高血压病大鼠性激素水平的影响

目的：观察解郁降压颗粒结合音乐疗法对围绝经期高血压病模型大鼠性激素的调节作用，初步探讨解郁降压颗粒结合音乐疗法治疗围绝经期高血压病的可能机制。方法：选用动情周期规律的SPF级雌性自发性高血压（SHR）大鼠，将其随机分成SHR组、假手术组、围绝经期高血压病模型组（简称模型组）、解郁降压颗粒加音乐疗法组（简称治疗组）；另设WKY大鼠作为正常血压对照组。通过摘除双侧卵巢方法建立围绝经期高血压病模型，待造模成功后，予以相应干预。治疗结束后测量血清雌二醇（E_{2）、促卵泡生成素（FSH）、促黄体生成素（LH）的含量，同时测量大鼠动脉血管的平均光密度值（OD值）。结果：与SHR组比较，治疗组血压下降，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，治疗组E22上升，OD值上升，FSH、LH含量下降，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：解郁降压颗粒结合音乐疗法对围绝经期高血压病模型大鼠有降压作用，且能提高SHR模型大鼠血清E22的含量，降低FSH、LH含量，改善SHR模型大鼠的内分泌环境；OD值上升，表示雌激素α受体（ERα）水平提高；而对内分泌环境的改善和ERα水平的提高可能是其降压机制之一。}     

牙鲆鱼耗氧率、氮排泄率与体重及温度的关系

对个体重２．５～３４．５ｇ的牙鲆幼鱼在不同水温（１２、１７、２２、２７℃）下的耗氧率和氮排泄率进行了测试和分析。结果表明，牙鲆幼鱼的耗氧率和氮排泄率均随体重的增加而增加，其差异均达到极显著水平（Ｐ＜０．０１）；牙鲆幼鱼的耗氧率随水温上升而增加，但仅２７℃组与其他３个温度梯度组分别比较，出现差异极其显著（Ｐ＜０．０１），后３个温度梯度组之间的差异则不显著（Ｐ＞０．０５）；牙鲆幼鱼的氮排泄率也随温度的提高而增加，其差异亦达到极显著水平（Ｐ＜０．０１）。作者认为，在牙鲆养殖生产过程中，养殖水体溶解氧应维持在３ｍｇ／Ｌ以上，养殖水温以不超过２７℃为宜。     

海豚链球菌及其胞外产物诱导的牙鲆血清抗体应答分析

海豚链球菌(Streptococcus iniae)是引起鱼类链球菌病的主要致病菌,对牙鲆(Paralichthys olivaceus)等养殖鱼类造成巨大危害。本文制备了海豚链球菌强毒株NUF849的福尔马林灭活全菌(FKC)、胞外产物(ECPs)及全菌与胞外产物的混合物(FKC+ECPs),以其免疫牙鲆,在免疫后第42天分别以海豚链球菌NUF849和NUF812攻毒,并在免疫前以及免疫后第7、14、21、28、35、42天与攻毒后第7天取样,分析3种免疫原以及免疫后再攻毒所诱发的血清抗体应答。结果显示,免疫后牙鲆体内产生了分别针对FKC和ECPs的特异性抗体,且各免疫组中FKC诱导的抗体水平较ECPs高,2种抗原间存在一定程度的交叉反应;FKC+ECPs组的两种抗体水平显著高于其他组(P0.05);攻毒后第7天2种抗体水平都显著升高(P0.05),并且免疫原来源菌株NUF849攻毒组的2种抗体水平高于非免疫原来源菌株NUF812攻毒组。攻毒后存活牙鲆的血清对NUF849、NUF812全菌蛋白及其胞外产物进行Western-blot分析,结果显示抗血清与全菌蛋白的阳性反应条带位于25~100kDa,与胞外产物的阳性反应条带位于18~100kDa。本文结果表明灭活海豚链球菌与胞外产物都能够诱发牙鲆产生特异性抗体,二者混合物的免疫效果更好,且NUF849来源的免疫原可以刺激牙鲆产生针对NUF812菌株的交叉保护抗体,为牙鲆海豚链球菌疫苗成分的筛选提供了基础资料。     

条斑紫菜锰超氧化物歧化酶原核表达及多克隆抗体制备

研究紫菜抗逆的分子机制,将本实验室克隆的条斑紫菜(Porphyra yezoensisUeda)锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,Mn SOD)基因全长cDNA克隆到质粒pET-30c(+)中,构建原核表达载体pET-S,转化大肠杆菌BL21(DE3)表达Mn SOD,表达产物的分子量约为30 KDa。利用不同浓度的Mn2+诱导重组Mn SOD的表达,可以检测到比活力随Mn2+浓度增高而上升的趋势。用重组Mn SOD免疫新西兰大白兔,制备了多克隆抗体,多克隆抗体的效价为1∶8 000。免疫印迹实验(Western Blot)表明该多克隆抗体具有很好的特异性。     

牙鲆病原秦皇岛弧菌的血清型及荧光抗体检验

用分离于病(死)牙鲆(Paralichthys olivaceus L.)的一种新病原弧菌——秦皇岛弧菌(Vibrio qinhuangdaora sp.nov.)的代表菌株(HQ010712-1株),分别制备全菌(OK)及热处理(121℃作用1h)的菌体(O)免疫原,强化免疫接种家兔制备相应抗血清,对供试12株秦皇岛弧菌进行了血清型检定,结果表明均存在同种的K抗原和同种的O抗原(血清同源),其中O抗原具有强免疫原性、K抗原的免疫原性弱但具有强O凝集抑制作用;以相应OK抗血清为第一抗体,以标准的羊抗兔IgG荧光抗体为第二抗体,对12株秦皇岛弧菌的纯培养物及用代表菌株(HQ010712-1)人工感染病死牙鲆的肝组织进行了间接荧光抗体染色,结果显示了特异的荧光反应。     

氯霉素单克隆抗体的研制及其特性分析

为了研制氯霉素单克隆抗体,建立氯霉素的简便有效的检测方法.采用碳二亚胺(EDC)方法制备氯霉素免疫抗原和包被抗原,经SDS-PAGE凝胶电泳,三硝基苯磺酸(TNBS)法鉴定表明偶联成功.采用制备的抗原CAP-HS-BSA((CAP-HS,氯霉素琥珀酸酯;BSA,牛血清白蛋白)免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术获得了2株抗氯霉素的杂交瘤细胞株,细胞株体外传代和冻存复苏后抗体分泌稳定.经体内诱生法产生腹水,ELISA检测纯化腹水的效价为1:10~6.抗体的亲和常数分别为:1.13×10~(10) L/mol,1.41×10~(10) L/mol.ELISA检测显示这2株单克隆抗体与氯霉素琥珀酸交叉反应率为300%,与其他抗生素及结构类似物的交叉反应小,表明该单抗可满足建立免疫学检测方法的需要和开发应用的要求.     

抗鳗弧菌单克隆抗体免疫保护作用的实验研究

本文对鳗弧菌感染牙鲆幼鱼为动物模型,对我们制备的五株抗鳗弧菌单抗４Ａ６,３Ｂ２,４Ｅ１２,３Ｅ７,３Ａ４的免疫保护效果进行了研究,结果表明：４Ａ６,３Ｂ２和４Ｅ１２具有明显提高受５ＬＤ＾５０鳗弧菌感染的牙鲆存活率的作用,同时它们还可明显延长受大齐量鳗弧菌（１０ＬＤ＾５０）感染的牙鲆的平均存活时间,揭示：４Ａ６,３Ｂ２和４Ｅ１２具有中和或减弱鳗弧菌毒性的作用。     

玻尿酸合成酶的鲨鱼源单域抗体筛选

在鲨鱼等软骨鱼类体内存在天然的缺失轻链、仅包含重链的抗体,源于这种重链抗体可变区的片段称为单域抗体(single domain antibody)。目前单域抗体研究中的抗原主要来源于水溶性蛋白或病原体,筛选膜蛋白鲨鱼源单域抗体的领域接近空白。本研究以重组表达的小球藻病毒玻尿酸合成酶(一种膜蛋白)为抗原,经过免疫、建库、淘选、验证等步骤获得了抗原特异性条纹斑竹鲨(Chiloscyllium plagiosum)单域抗体序列。随后利用大肠杆菌表达了该单域抗体,通过等温滴定量热技术(ITC)测定了其与抗原的亲和力,证实了以膜蛋白作为抗原制备鲨鱼源单域抗体的可行性。     

大黄鱼病原副溶血弧菌单克隆抗体制备及其应用

用甲醛灭活副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和溶藻弧菌(V.alginolyticus)制成免疫原免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,获得1株特异的针对副溶血弧菌的单克隆抗体,命名为D6F3H5。腹水及培养上清液抗体的ELISA效价分别为:1∶5 120和1∶1 280,该单克隆抗体与其它细菌没有明显的交叉反应。利用该单克隆抗体和兔抗副溶血弧菌多克隆抗体,建立了检测副溶血弧菌的双抗体夹心ELISA方法。该方法对副溶血弧菌的最小检出量为5×104个/mL。用双抗体夹心ELISA检测大黄鱼(Pseudosciaena crocea)样品,14尾患病大黄鱼中有11尾检出副溶血弧菌,而10尾健康大黄鱼都没有检出副溶血弧菌。由此可见,本试验制备的高特异性的抗副溶血弧菌单克隆抗体,可以用于患病大黄鱼副溶血弧菌的快速诊断。     

抗紫红笛鲷血清免疫球蛋白单克隆抗体的制备

采用蛋白A－sephrose亲和层析法，分离提纯了紫红笛鲷Lutjanus argentimaculatus的血清免疫球蛋白（Ig)，并制备了抗紫红笛鲷血清Ig分子的单克隆抗体。经间接ELISA，免疫印迹（western blotting)的检测和鉴定，得到抗紫红笛鲷Ig分子重链的单抗6株，分别为IgG11株，IgG23株，IgG2a1株，IgG31株。这6株抗紫红笛鲷Ig的单抗各有1株与同为鲈形目的青石斑鱼Epinephelus awoara和尖吻鲈Lates calcarifer的Ig分子有很弱的交叉反应，而同鲽形目的牙PingParalichthys olivaceus的Ig分子没有交叉反应，具有较强的种间特异性；同时揭示，同目不同属的鱼类血清Ig之间的相似度较低，不同目之间的相似度极低。     

应用荧光抗体技术检测牙鲆体内的河流弧菌

用灭活的河流弧菌(Vibrio fluvialis)抗原,注射免疫实验兔,制得凝集价为1∶5 120的抗血清。用试管凝集法检测了抗血清的特异性,再用免疫吸附法去除交叉反应,从而得到高效价、高特异性的抗河流弧菌血清。用所制备的抗血清在实验室中建立起河流弧菌荧光抗体检测技术(FAT),在荧光显微镜下可清楚地看到被标记的病原菌,整个检测过程只需3h。用河流弧菌感染牙鲆(Paralichthys olivaceus),24 h后,用FAT测定牙鲆的血液、肾脏和肝脏中的河流弧菌,在血液中河流弧菌的检出率最高,其次是肾脏,肝脏的检出率最低。以上结果表明:荧光抗体技术可以快速、灵敏、准确地检测出牙鲆体内的河流弧菌。     

软骨藻酸多克隆抗体的制备

为建立软骨藻酸(DA)的免疫检测法,本研究采用活泼酯法将DA与载体蛋白KLH(BSA)偶联形成完全免疫抗原(包被抗原),并通过紫外光谱扫描证明偶联成功与否。用完全免疫抗原DA-KLH对新西兰白兔进行免疫,间接ELISA法测定血清效价。实验结果表明偶联成功,经过19周免疫后血清效价达到1:1600,纯化后获得效价为1:800的多克隆抗体,同时也间接证明了合成的完全抗原具有免疫原性,为以后建立免疫分析法奠定了基础。