凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)病原副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的表型及分子特征

采用常规的形态及生理生化特性检验及分子生物学等方法,对引起凡纳滨对虾幼虾发生毁灭性死亡的病原菌进行了致病性、表型生物学及分子生物学的系统研究。结果表明,分离菌为弧菌属(Vibrio Pacini 1954)的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus),对凡纳滨对虾、中国对虾及日本对虾仔虾均有强致病性。分离鉴定的4株副溶血弧菌具有淀粉酶、明胶酶、卵磷脂酶活性,但不具有蛋白酶、脂肪酶活性,KP溶血均呈阴性,且均具有K抗原;代表菌株(JGB080708-1株)的16S rRNA基因序列(长度为1456bp,GenBank登录号为GQ205448)和gyrB基因序列(长度为1195bp,GenBank登录号为GQ205453)与副溶血弧菌的两种基因序列相似性均可达98%以上。病原菌的耐药性检测结果显示,对供试49种抗菌药物中的林可霉素等6种药物耐药。     

养殖大黄鱼(Pseudosciaena crocea)3种致病弧菌的分子鉴定及其系统发育学分析

从患病养殖大黄鱼分离到3株病原菌H040823-1、H050704-1、H050815-1,经常规生理生化鉴定均属于弧菌属的种类,API20E快速鉴定菌株H040823-1为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyti-cus),菌株H050815-1为溶藻弧菌(V.alginolyticus),菌株H050704-1不在API20E鉴定谱内。为了进一步确定其分类地位,测定了3株病原菌的16S rRNA和HSP60(heat shock protein,HSP60)基因部分序列。16S RNA基因系统进化分析表明,3株病原菌与副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌亲缘关系较近,相互之间同源性均大于96.9%,差异不明显。HSP60基因序列分析表明,菌株H040823-1、H050704-1、H050815-1的HSP60基因序列分别与V.parahaemolyticus(AF230951)、V.harveyi(EU036994)、V.alginolyticus(DQ664545)的同源性最高,分别为96.7%、99.8%和98.0%,而与其他弧菌HSP60基因的同源性均低于91.9%,3株病原菌相互之间同源性低于92.3%,差异显著。HSP60基因构建的系统进化树表明,H040823-1、H050704-1、H050815-1分别与V.parahaemolyticus、V.harveyi、V.alginolyticus聚类。综合以上结果,菌株H040823-1、H050704-1、H050815-1可分别鉴定为副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌。结果表明,HSP60基因比16S rRNA基因更适合用于海水鱼类致病性弧菌种间的分类研究。     

三疣梭子蟹病原副溶血弧菌的分离与鉴定

从养殖病死三疣梭子蟹肝胰脏及心脏血淋巴液中分离到大量优势生长的细菌,人工感染试验证明分离菌对三疣梭子蟹有较强的致病性;对分离菌进行了形态特征、理化特性、胞外酶及溶血素活性等表型生物学性状及16S rRNA和gyrB两种基因的分子鉴定。菌株(JGX080708-1)所扩增的16S rRNA基因序列长度为1453bp(GenBank登录号:FJ824663),所扩增的gyrB基因序列长度为1191bp(GenBank登录号:GQ372985);两种基因序列在NCBI通过blast检索,结果均与弧菌属细菌的基因序列自然聚类;根据分离菌的表型及分子特征,判定分离菌为弧菌属(Vibrio Pacini1954)的副溶血弧菌[Vibrio parahaemolyticus(Fujino et al1951)Sakazaki Nakamura and Takizawa1963]。分离菌的药敏试验结果显示,对供试49种抗菌药物中的安曲南等42种药物高度敏感,对林可霉素敏感,对青霉素G等6种药物耐药。     

分子鉴定方法研究大亚湾水体弧菌种类变化

借助分子鉴定方法监测大亚湾水体中弧菌Vibrio种类季节性动态的变化规律.通过增菌培养、菌株分离,在224份海水中共分离出弧菌368株,并用分子生物学辅助生化鉴定方法鉴定弧菌菌株.结果表明,在大亚湾海域水体中鉴定的弧菌种类有溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、副溶血弧菌V.parahaemolyticus、哈氏弧菌V.harveyi和创伤弧菌V.vuinificus,没有检测到霍乱弧菌V.cholerae、拟态弧菌V.mimicus、河流弧菌V.fluvialis和霍利斯弧菌V.hollisae.溶藻弧菌和副溶血弧菌为优势菌群,分别占弧菌总数的27.99%和21.74%.     

中国对虾养成期细菌性黑鳃,褐斑综合症的病原生物学研究

本文是对中国对虾黑鳃、褐斑综合症进行病原菌分离和人工感染试验的报告。经细菌学鉴定表明,分离菌分别为海弧菌Vibrio pelagius Baumann和溶藻弧菌Vibrio alginolyticus sakazaki。人工感染试验显示,海弧菌是引起对虾黑鳃、褐斑综合症的主要病原菌,溶藻弧菌的合并感染导致对虾败血死亡。此外还应用电子显微镜对分离纯化的病原细菌进行了超微结构观察。     

红鳍东方鲀(Takifugu rubrips)病原杀对虾弧菌的主要生物学特性研究

采用表观分类学及分子生物学方法,对从发病的养殖红鳍东方()中分离的细菌进行了主要生物学特性研究.主要包括形态特征、理化特性等较系统的表观分类学指征鉴定;同时对代表菌株进行了16S rRNA基因的分子鉴定,测定了16S rRNA基因序列、分析了相关细菌相应序列的同源性、构建了系统发生树;结果表明,分离菌为弧茵属(Vibrio Pacini 1954)的杀对虾弧菌(Vibrio penaeicidasp.nov.Ishimaru et al 1995).代表菌株(Hc051105-6株)16s rRNA基因序列长度(不包括引物结合区)为1443bp(GenBank登录号:EU073023),代表菌株(HC051105-8株)16S rRNA基因序列长度(不包括 引物结合区)为1450bp(GenBank登录号:Eu073024).择代表菌株做对健康红鳍东方鲀的人工感染试验,认为分离鉴定的杀对虾弧菌在被检红鳍东方鱼电病例具有一定的病原学意义.药敏试验结果显示,对供试37种抗菌药物中,在一些药物中存在耐药性的菌株间差异.     

工厂化养殖杂色鲍致病菌副溶血弧菌的分离鉴定及其生理特性

从广东汕尾地区工厂化养殖的患病和死亡的杂色鲍(Haliotis diversicolor)及养殖海水中分离到3株优势菌,经回归感染试验,证实所分离的细菌为杂色鲍的致病菌。经形态、生理、生化等多项指标鉴定,该菌株为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus),并经ATB微生物自动鉴定系统证实鉴定结果。在中国大陆,由副溶血弧菌使杂色鲍致病并大量死亡的事件,本文属首次报道。     

中国对虾幼体致病菌哈维氏弧菌的分离及其生物学特性研究

于1996年4—5月,在青岛丰城地区一些对虾育苗场发生大规模爆发性传染病,主要感染中国对虾幼体,尤其是蚤状幼体。死亡率高达80％以上。从自然发病及人工感染患病濒死中国对虾幼体中分离出38株细菌,研究其形态特征,生理、生化特性及对中国对虾幼体的致病性。结果表明,38株分离物均为革兰氏阴性杆菌,菌体为杆状或短杆状,极生单鞭毛运动,不发光,氧化酶呈阳性,发酵葡萄糖产酸,TCBS平板上生长,菌落呈黄色或绿色,对弧菌抑制剂0／129（150g／ml）敏感,此均为弧菌属的典型特征,属于弧菌。其中26株细菌被归为同一类群,参照伯杰氏细菌学鉴定手册（1994年,第9版）鉴定表明,该菌同哈维氏弧菌（Vibrioharveyi）最为接近;另外,Biolog系统鉴定表明也为哈维氏弧菌,因此定名为哈维氏弧菌。利用浸泡感染法以2．5×103—2.5×107cfu／ml浓度的细菌感染不同发育时期（无节幼体期、蚤状期、糠虾期和仔虾期）的中国对虾幼体。结果表明,该病原菌主要感染中国对虾幼体的无节幼体晚期、蚤状期和糠虾早期并导致其大量死亡,而在仔虾期感染死亡率较低,并且2．5×104cfu／ml以上浓度的病原菌即可导致蚤状幼体严重感染死亡,由此可见,所分离的致病菌对中国对虾蚤状期幼体具有较强的致病力。人工感染试验结果     

4株长牡蛎(Crassostrea gigas)致病性哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)鉴定及其毒力基因检测

为明确江苏连云港养殖长牡蛎大规模死亡病因,对分离自长牡蛎的4株病原菌开展了致病性、表型特征、分子特征等研究,结果表明4株病原菌均具致病性,4株病原菌ML1、ML2、ML3、ML4对长牡蛎的半数致死量LD50分别为2.8×105、1.1×105、1.8×105和1.6×105 CFU/mL;4株病原菌均为呈短杆状革兰氏阴性细菌,氧化酶阳性,还原硝酸盐,能利用甘露醇、纤维二糖,形态及理化特性结果表明4株分离菌与弧菌属的哈维氏弧菌亲缘关系最近;16SrRNA、gyrB、rpoA基因同源性检索及系统发育学分析结果表明4株分离菌与GenBank数据库中哈维氏弧菌的基因序列相似性最高且在系统发育树中聚为1个分支;根据4株分离菌的致病性、表型与分子特征,表明引起长牡蛎大规模死亡的病原为哈维氏弧菌。为进一步明确分离菌株毒力基因的携带情况,检测了分离鉴定的4株病原菌的9种毒力基因,结果表明,4株病原菌均可检测到luxR、toxR、vhhA和vhhB 4种毒力基因,扩增片段大小分别为679bp、390bp、1324bp和216bp,其他5种毒力基因未检测到,且分离鉴定的4株病原哈维氏弧菌携带相同的毒力基因,这些毒力基因可作为检测致病性哈维氏弧菌的分子标记。     

拟态弧菌全长toxR基因的克隆和序列分析

对克隆的拟态弧菌Vibrio mimicus的全长toxR基因及进行相关的序列分析.根据已发表的其他几种弧菌toxR基因两翼核苷酸序列,设计和合成上下游简并引物,以拟态弧菌1.1969标准株的基因组DNA为模板进行PCR扩增,将获得的1.3kb扩增片断进行克隆、鉴定和测序,并将该序列提交至GenBank (登录号为EF693743).首次获得拟态弧菌840bptoxR基因全长核苷酸序列.与其它弧菌的相应序列分析比对显示,该序列与霍乱弧菌Vibrio cholerae的toxR基因有87%-88%的相似性,与鳗弧菌Vibrio anguillarum的toxR基因有75%的相似性,与副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus的toxR基因有45%的相似性.该基因编码1个含有279个氨基酸残基的蛋白质,其分子量为31.13kDa,等电点为5.35,并含有一个典型的转录激活区和一个跨膜区.系统发育树分析表明,几种常见致病性弧菌的toxR基因序列存在较大分歧,拟态弧菌能较容易与进化相近的霍乱弧菌鉴别区分开来.toxR基因全长核苷酸序列的获得将为拟态弧菌的菌种鉴定增添新的分子靶标,有助于其结构和功能的研究及通过突变分析鉴定出新的受toxR基因调控的致病基因.     

苗期中国对虾幼体异养细菌区系及其变化与病害发生的关系

研究了2个育苗场不同发育期的中国对虾(Penaeus chinensis)幼体的异养菌和弧菌种群变化的动态过程。以典型特征法、BIOLOGGN法和数值分类法对菌株进行鉴定。结果表明，对虾幼体样品中所分离的细菌，大多是革兰氏阴性杆菌。鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas)、气单胞菌属(Aeromonas)和弧菌属(Vibrio)。弧菌属主要为溶藻弧菌(Vibrioal-ginozyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)。在对虾幼体发育早期，假单胞菌(Pseudomonas)和气单胞菌(Aeromonas)占优势，随着对虾幼体的发育，弧菌(Vibrio)渐成为优势，其中溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)优势明显。二者的消长与苗期病害的发生相关，溶藻弧菌总是在虾幼体健康时出现或成为优势，而哈维氏弧菌成为优势时，苗期病害容易发生。     

患病与健康杂色鲍苗中弧菌胞外产物的比较分析

本实验室于2004年采样自广东深圳下沙鲍鱼场变白掉板杂色鲍苗以及官湖养殖场健康鲍苗,各分离到16和34株弧菌,并对其胞外产物进行了比较分析。结果表明,官湖场健康鲍苗弧菌与下沙场患病鲍苗弧菌相比,前者20.59%(7株)菌株虽不分泌胞外酶但具溶血活性,余之菌株(64.71%,22株)或分泌酶和/或具溶血活性,但同时兼具蛋白酶、明胶酶、卵磷脂酶、脂肪酶和溶血活性的极少(5.88%,2株);后者则所有菌株均分泌胞外酶和/或具溶血活性,25.00%(4株)菌株能分泌四种酶及具溶血毒性,其余菌株(68.75%,11株)可分泌多种酶和/或具溶血活性。结果揭示,下沙鲍鱼场患病鲍苗弧菌分泌胞外酶和具溶血活性的能力明显强于官湖场健康鲍苗弧菌的,同时认为菌株X99-2和X100-8与下沙鲍苗病害潜在相关。     

大黄鱼病原弧菌拮抗放线菌的筛选与人工诱变

从厦门集美海滩底泥分离得到38株放线菌，用琼脂块法测定它们对大黄鱼病原弧菌-溶藻弧菌和副溶血弧菌的拮抗效果，选择两株拮抗效果较好的放线菌进行诱变，测定诱变后各菌株的抗菌效果，并选择抗菌效果较好的菌株进行第二次诱变，如此反复诱变3次，共得到97株放线菌，结果表明；38株放线菌中的22株对两株病原菌有一定的拮抗作用；用紫外线照射可以获得少量对两株病原菌拮抗作用加强的菌株。     

Molecular identification of scallop planktonic larvae using species-specific microsatellites

The identification of scallop larvae is essential to understand the population structure and community dynamics and to assess the potential environmental impacts caused by scallop larvae released or escaped. However, the larvae identification by morphological characteristics is notoriously difficult, mainly due to the small size （usually being less than 150 μm） and vague morphological characteristics among different scallop species. A simple and accurate molecular method was developed to identify four economically farmed scallop species, the Zhikong scallop Chlamys farreri, the noble scallop C. nobilis, the bay scallop Argopecten irradians and the Yesso scallop Mizuhopecten yessoensis. The tests used the high degree of species-specific microsatellite markers, which was specified by transferability analyses, assessed by reference individuals and evaluated by BLAST searches. The sensitivity test indicated that the species-specific microsatellites were sensitive enough for the detection of 1% -2% larvae in mixed plankton samples. Larvae collected from scallop hatcheries and their effluents and from the artificially controlled crosses were well identified to the species/hybrid level. The results demonstrated that the one-step PCR-based assay was technically simple, inexpensive and robust in identification analyses, and also less sensitive to initial quality of template DNA extracted from the ethanol-preserved samples for several years.     

Occurrence and distribution of vibrios in fishes and shellfishes in coastal waters of Hong Kong

INTRODUCTIONTheoccurrenceanddistributionofhalophilicvibriosinthecoastalwatersofHongKonghasbeenrePorted(Chanetal.,l986).Theresultsshowedthatvibrioswerepresentduringthesum-mermonthsinHongKongcoastalwatersatconcentrationsof9oto67ooind./cm3,accountingo.4l%~4o%ofthetotalbacterialPOpulationofthe48isolatesexaminedindetail.Theyob-servedV.Paraheamolyticus,V.harvha,V.vulnfficus,V.camPbelliandV.fiuvialis.Becausemanyofthevibri0species,includingsome0ftheisolatesbyChanetal.(1986)fromHongKongwate…     

Ecology of Vibrios in the Oliveri-Tindari Lagoon (Messina), Two-Year Study

Abstract. A two-year ecological study in the Oliveri-Tindari (Messina) brackish water ponds evaluated the quantitative and qualitative distribution of Vibrio species in relation to the physicochemical conditions of the ponds.
The evaluation of 204 samples shows a general relationship between the halophilic vibrios and water temperature. In particular this relationship is stronger for the Vibrio fraction able to grow at 37°C, i. e. , those species related to human infections. On the other hand, the halophilic vibrios show no relation with the index of fecal contamination.
The ecology of V. parahaemolyticus is discussed in relation to the salinity of Marinello pond.
The distribution of V. cholerae non O1, isolated from all ponds, shows that this microorganism can be considered as autochthonous in coastal environments.     

基于肥满度-最大养殖收益的底播养殖虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)养殖容量评估及养殖区区划

养殖容量评估是合理规划养殖区的基础。基于虾夷扇贝养殖生态系统模型,模拟了2006年12月至2017年11月不同放苗密度下底播养殖虾夷扇贝的生长情况。在考虑肥满度对虾夷扇贝养殖收益的影响下,计算最大养殖收益及其对应的最适放苗密度和养殖容量,并通过最大养殖收益及其年际差异的聚类分析结果进行养殖区区划。结果表明:考虑扇贝肥满度的养殖收益能很好的抵消扇贝品质对养殖收益的影响;底播养殖虾夷扇贝的养殖容量和最适放苗密度有明显的时空差异,獐子岛和小长山岛之间并向长海海域东北部延伸的条带海域是高收益区;中收益区在高收益区南北两侧;低收益区位于研究区西北部和南中收益区南部;研究区南部由于饵料匮乏导致扇贝生长缓慢,为不适宜养殖区。开阔海域养殖容量也是有限的,片面增加放苗密度并不能达到增产增收的效果。研究结果可为合理规划和管理养殖区提供参考。     

光合细菌对致病弧菌的抑制作用

本文主要介绍5株光合细菌对3株致病弧菌的抑制作用研究,结果表明,在不同的培养基中其抑菌效果不同,在普通培养基中No.3PSB对副溶血弧菌和河弧菌有明显的抑制作用,但在TCBS培养基中,则无抑菌效果,在培养基I中,No.1和No.2 PSB对3株致病弧菌的抑制作用皆取得良好的效果。     

3种致病弧菌感染对大黄鱼7种酶活性的影响

大黄鱼溃疡病主要由3种致病弧菌引起:溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、哈维弧菌V. harveyi和副溶血弧菌V. parahaemolyticus。为了解大黄鱼抗病原菌感染的免疫反应机理,对其疾病防御提供重要的理论基础,本实验将健康的大黄鱼随机分为3个实验组和1个对照组,分别注射0.2 mL的哈维弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌及灭菌生理盐水。在人工感染后的第0,1,2,4,7,10,13,16,20天分别采样,通过测定每组大黄鱼血清中7种免疫相关酶活性,比较这3种致病弧菌对大黄鱼影响的差异性。结果表明:在感染后的1～10 d,实验组大黄鱼血清中血清溶菌酶(LSZ)、酸性磷酸酶(ACP)、过氧化物酶(POD)、髓过氧化物酶(MPO)的活性变化,总体表现为先升高、后降低再逐渐升高最后趋于-致的现象,且不同病原菌之间存在-定的时效差异。 碱性磷酸酶(AKP)对入侵体内的哈氏弧菌反应较敏感,ACP、POD和MPO对溶藻弧菌反应较敏感,LSZ和PO对副溶血弧菌反应较敏感。