半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)Patched 1基因的克隆和表达分析

Hedgehog(Hh)信号通路在脊椎动物和非脊椎动物发育过程中细胞信号传导方面发挥重要的作用。Patched 1 (Ptc1)基因是Hh的受体,通过和Hh配体结合调节Hh信号通路。本研究克隆和鉴定了半滑舌鳎的Ptc1基因(csptc1),该基因cDNA全长为5212 nt,编码蛋白包括1543个氨基酸残基,序列比对和进化分析显示该蛋白在进化过程中较为保守。荧光定量显示该基因在脑,肝脏,心脏,鳃,肠,脾脏、肾脏和性腺组织中普遍表达,在精巢中的表达水平显著高于卵巢。精巢中的原位杂交信号主要位于该基因主要在初级精母细胞,次级精母细胞和支持细胞中,而在卵母细胞中的信号较弱。Csptc1基因在卵巢中的甲基化水平高于在雄鱼和伪雄鱼精巢中。这一研究结果可能说明csptc1基因参与了 Desert Hedgehog (DHH)基因维持雄鱼和伪雄鱼的生殖细胞系以及精子发生等生物学过程。     

文昌鱼Gcm2-like基因的进化与表达

Gcm(Glial cells missing)是含Gcm-motif的转录因子。在果蝇中,Gcm决定神经元细胞与胶质细胞的分化命运;而在哺乳动物中,Gcm基因有Gcm1和Gcm2两种形式,主要表达于非神经组织,分别参与尿囊绒膜和甲状旁腺的形成。故Gcm在无脊椎动物与脊椎动物中的功能是有差异的,但对其是怎样进化的并不清楚。文昌鱼是在进化中接近脊椎动物的无脊椎动物,是进化研究的良好模式生物。本文利用生物信息学方法鉴定出文昌鱼基因组中存在Gcm2-like基因,并对其进化与表达进行了研究。Gcm2(或Gcm2-like)基因存在于从刺胞动物到哺乳动物的各物种中,而Gcm1基因仅从两栖动物中才开始出现。无脊椎动物的Gcm2-like基因可能代表了脊椎动物Gcm1和Gcm2基因分化前的原始形式,且无脊椎动物的Gcm2-like基因可能与脊椎动物的Gcm2基因直系同源。另外,通过利用RT-PCR和原位杂交技术对文昌鱼Gcm2-like基因的表达进行了检测发现:Gcm2-like基因主要在文昌鱼的鳃、肠和肝盲囊中表达,特别是在鳃中明显高表达,支持哺乳动物甲状旁腺起源于鳃的观点。本研究为进一步揭示Gcm功能的进化奠定了基础。     

雌雄文昌鱼差异表达基因的转录组分析

本文用转录组学技术系统考察了雌雄文昌鱼的差异表达基因。将性腺发育成熟的青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri)雌雄分离,分别对排卵前雌鱼(F1组)和释精前的雄鱼(M1组),以及排卵后雌鱼(F2组)和释精后的雄鱼(M2组)进行了转录组测序。分析显示:排卵与释精前的雌雄文昌鱼(F1组与M1组)有13 434个显著差异表达的基因,排卵与释精后的雌雄文昌鱼(F2组与M2组)有5 957个显著差异表达的基因;不论排卵与释精前还是后,相比于雄性,雌性文昌鱼低表达的基因均多于高表达的基因。对各组间差异表达基因进行KEGG通路聚类分析,发现排卵与释精前(F1组与M1组),雌雄文昌鱼中差异表达的基因极显著地富集到7个KEGG通路中,分别为神经活性配体-受体相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、细胞粘附分子(Cell adhesion molecules)、造血细胞系(Hematopoietic cell lineage)、肥大型心肌病(Hypertrophic cardiomyopathy)、细胞外基质相互作用(ECM-receptor interaction)、PI3K-Akt信号通路和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染;而排卵与释精后(F2组与M2组),雌雄文昌鱼中差异表达的基因极显著地富集到3个KEGG通路中,包括神经活性配体-受体相互作用、细胞粘附分子、病毒性心肌炎(Viral myocarditis)。进一步分析发现,与血管内皮生成相关的基因如F11R、JAM2、CDH5等,雌性都比雄性文昌鱼呈显著的高表达。     

GnRH-A激发文昌鱼性腺发育的初步研究

本文报道了文昌鱼性腺尚未重新开始发育时,给予合成促性腺激素释放素类似物(GnRH-A),每隔8和12天在显微镜下检查两组性腺发育情况.研究结果表明,GnRH-A处理过的文昌鱼,性腺重新发育比对照早,性腺发育与分化程度比对照高.表明GnRH-A可激发提早和促进文昌鱼性腺的发育.我们认为,象脊椎动物一样,GnRH-A也是调控文昌鱼性腺发育的重要激素.     

文昌鱼胚胎整装荧光原位杂交技术的建立

文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)是进化发育生物学研究的重要模式生物,文昌鱼胚胎整装荧光原位杂交(WFISH,whole-mounted fluorescent in situ hybridization)技术将有助于鉴定文昌鱼胚胎发育过程中具有重要调控作用的功能基因。报告了文昌鱼胚胎整装荧光原位杂交技术,用以快速灵敏分析特定基因在文昌鱼胚胎发育过程中的时空表达图式。用体外转录合成的地高辛标记文昌鱼FGFR基因的反义RNA探针,检测到FGFR在文昌鱼原肠胚中表达于发生内陷的中内胚层细胞中,而预定发育为外胚层的细胞不表达FGFR。     

文昌鱼与比较基因组学和分子发育生物学

文昌鱼是现存的与脊椎动物原始祖先最接近的无脊椎动物，长期以来一直作为研究动物进化和胚胎发育的典型材料。目前，文昌鱼的基因序列和表达模式已经被广泛用于不同物种之间的比较基因组学研究和发育同源性分析中。文昌鱼独特的进化地位和它未经复制的基因组使其在比较基因组学中有着无可比拟的优越性，通过对文昌鱼、无脊椎动物和脊椎动物的基因组之间的比较，可以揭示脊椎动物原始祖先基因组的结构和演化过程进而探索人类的起源。同时，通过对文昌鱼和其它物种发育基因表达图式的比较可以显示不同生物身体部位之间的同源关系，并可以了解发育基因是如何引起不同物种之间形态变化的。     

文昌鱼实验室饲养与繁殖

<正>文昌鱼(amphioxas或lancelet)属于脊索动物门(Chordata)、头索动物亚门(Subphylum Cephalochordata)、文昌鱼纲(Amphioxi)、文昌鱼目(Amphioxiforms)、文昌鱼科(Amphioxidae),有2属或3属(有争议),它们是鳃口文昌鱼属(Branchiostoma),侧殖文昌鱼属(Epigonichthys),偏文昌鱼属(Asymmetron)。早在5.2亿年前就已经出现,是无脊椎动物进化到脊椎动物的过渡类型,也是脊椎动物的祖先原型。因其具有个体小、产卵量大、体外受精和发育以及胚胎透     

北部湾的文昌鱼

文昌鱼是海洋稀有的原始脊索动物,它不但有很高的经济价值,而且是研究动物进化系统的一种珍贵材料。我国的文昌鱼,据以往报道,主要分布在福建厦门同安刘五店和山东青岛、烟台等地。1982年7月至1985年3月,我们在北部湾进行文昌鱼资源调查,采到的文昌鱼经鉴定为白氏文昌鱼(Branchiostoma belcheri Gray,即厦门文昌鱼,图版Ⅰ:1)。现将它的形态特征、生态习性和采捕方法叙述如下。     

室内培育条件下青岛文昌鱼性腺的年周期发育

青岛文昌鱼(Branchiostoma japonicus)采自于青岛沙子口海区,在室内进行周年培育。每月采集样品,经测量、固定以及组织切片观察,研究了其周年卵巢和精巢的发育规律。结果表明,室内培育的文昌鱼一周年内全长没有明显变化,仅体质量在繁殖期即其性腺发育至Ⅴ期时有明显增大(P0.05=,精卵排空后则恢复原来体质量。文昌鱼1 a内在夏季6～7月繁殖1次,能自行排放卵和精子,排空后个体的卵巢或精巢,在适宜的条件下,经历Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ期的发育过程,进行下一轮的性腺发育。文昌鱼精巢在Ⅳ期前先于卵巢发育,两者在Ⅳ期前发育都不同步,精巢处于Ⅳ期时间较长,一般从3月持续到5月,而卵巢处于Ⅳ期一般是在4月～5月。     

从无脊椎动物到脊椎动物的纽带——头索动物文昌鱼

头索动物文昌鱼是现存的最接近脊椎动物的无脊椎动物,它的形体结构简单却具有脊索动物的基本特征,而且其没有经过大规模复制的基因组结构与脊椎动物的始祖很接近。文昌鱼占据着重要的进化地位,并且长期以来在进化生物学和发育生物学等研究领城中一直作为模式动物,本文从文昌鱼的发现、形态结构、物种及分布、生活习性和胚胎发育等方面作以阐述。     

厦门文昌鱼及其保护

文昌鱼是一种珍贵海洋动物。它的形态结构特殊,既有无脊椎动物的特征,又有脊椎动物的特征。因此,被认为是无脊椎动物进化到脊椎动物的过渡类型与典型代表。人们将文昌鱼视为脊椎动物的祖先,主要是根据它的结构具有鳃裂、脊索和神经管为依据的。文昌鱼作为生物科学研究的重要对象和生物教学的宝贵材料,长期以来一直受到国内外生物学家和进化论者的高度重视。文昌鱼还是一种营养丰富、味道鲜美的海珍品,     

厦门文昌鱼性腺发育的周年变化

本文通过对厦门海区文昌鱼性腺发育的周年观察,测定成熟系数以及年龄和性腺发育的关系.作者认为厦门文昌鱼生殖季节为5月上旬-7月,6月为生殖旺季.文昌鱼种群在海区的性腺发育是不同步的,但卵母细胞从大生长期以后的发育则是同步的,属一次性产卵或释精,其后性腺消失.每尾成年文昌鱼一年只生殖一次.当年生文昌鱼,翌年性腺即可成熟,4龄文昌鱼仍有生殖能力.最后,文中讨论了水温与文昌鱼性腺发育的相互关系.     

文昌鱼嘌呤代谢酶基因:结构与演化

嘌呤代谢是动物含氮废物排出体外的重要途径之一.嘌呤代谢终产物在不同动物各不相同.这是由于进化过程中,参与代谢1种或多种酶基因或者酶活性的丢失所致.本文从JGI网站佛罗里达文昌鱼基因组数据库中搜索文昌鱼参与嘌呤代谢主要5种酶(黄嘌呤脱氢酶、尿酸酶、尿囊素酶、尿囊酸酶、尿素酶)的基因,并且将它们与其他12种具有代表性且基因组序列已知的动物包括人、小鼠、狗、鸡、爪蟾、河豚、斑马鱼、海鞘、海胆、果蝇、线虫、海葵的基因结构进行比较.结果发现文昌鱼参与嘌呤代谢的酶基因有的和脊椎动物基因相似(黄嘌呤脱氢酶和尿酸酶),有的和脊椎动物与无脊椎动物的基因都不相似(尿囊酸酶),还有的和无脊椎动物海胆与海葵基因外显子个数与内含子相位都相似但外显子之间缺乏对应关系(尿素酶).所有这些都支持文昌鱼代表脊椎动物始祖代表类型,同时兼具特化特征的观点.尿素酶基因存在于水生无脊椎动物中,而在陆生的果蝇和线虫中均未发现尿素酶基因,因而我们推测随着动物由水生向陆生进化,参与尿素分解的尿素酶基因可能在陆生动物中完全丢失.     

文昌鱼同源框基因研究进展

十几年以前脊椎动物Ｈｏｘ基因的发现给全世界的发育生物学家以极大的鼓舞,人们期待着在不同的动物物种之间发现共同的图式形成机制。有人甚至认为同源框基因是解决发育生物学疑难问题的灵丹妙药。经过十几年的深入研究,发现在大多数真核生物中都有同源框基因。其中有几类同源框基因的生物学功能在进化中高度保守,但在不同的分类单元中,基因的数目、基因组的组织形式和基因表达等方面却有着细微的差异［１］。有人认为,同一类同源框基因在不同的分类单元中的数目和表达的差异与这些动物躯体设计的进化有关［１］。１文昌鱼的进化地位脊索动…     

青岛文昌鱼肌球蛋白重链基因片段的重组表达

将青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)肌球蛋白重链基因片段亚克隆到pET-30a质粒,构建出重组表达载体并转化入大肠杆菌Escherichia coli BL21中.经SDS-PAGE和Western杂交检测表明,在IPTG诱导下含有重组载体的菌株可表达分子质量约30 ku的融合蛋白.诱导条件优化实验结果显示,该菌株经0.2 mmol/L IPTG诱导1 h就可大量表达此蛋白.可溶性实验确认该重组蛋白是可溶性蛋白.本研究为文昌鱼肌球蛋白重链特异性抗体的制备奠定了基础.     

水温对文昌鱼生殖活动的影响及其内分泌机制

采用慢性实验方法,研究在不同水温条件下饲养性腺发生前的文昌鱼(Branchiostoma belcheri)对其性腺分化和发育的影响。另外,在繁殖季节研究在低温16℃、中温22℃和高温28℃下饲养性成熟的文昌鱼对其产卵和排精的影响。同时,采用免疫组织化学方法对几种生殖相关激素在不同发育期文昌鱼的生殖调控轴(脑-哈氏窝-性腺)中的分布进行免疫识别,并用磁酶免定量测定方法检测睾酮和17 β-雌二醇在文昌鱼性腺中的含量,以分析和探讨水温影响文昌鱼生殖活动的内分泌机制。结果表明:低温有利于文昌鱼性腺向雌性分化,雌雄比例为4.2:1,中温和高温组则不受影响,雌雄数量大致相等。高水温则有利于文昌鱼的精巢发育和生精活动。28℃海水适于文昌鱼的产卵和排精。根据免疫组织化学和磁酶免定量测定的结果分析提示,温度影响文昌鱼性别分化和发育以及繁殖活动的内分泌机制是:首先水温经皮肤或哈氏窝化学感受器,刺激神经系统(脑泡)释放GnRH。然后GnRH促进哈氏窝分泌LH,从而可能刺激性腺产生和分泌性类固醇激素,始动文昌鱼性腺的发育至成熟及其生殖活动。此外,脑中芳香化酶可能介导文昌鱼性别分化。     

水温对文昌鱼生殖活动的影响及其内分泌机制

采用慢性实验方法,研究在不同水温条件下饲养性腺发生前的文昌鱼(Branchiostoma belcheri)对其性腺分化和发育的影响。另外,在繁殖季节研究在低温16℃、中温22℃和高温28℃下饲养性成熟的文昌鱼对其产卵和排精的影响。同时,采用免疫组织化学方法对几种生殖相关激素在不同发育期文昌鱼的生殖调控轴(脑-哈氏窝-性腺)中的分布进行免疫识别,并用磁酶免定量测定方法检测睾酮和17 β-雌二醇在文昌鱼性腺中的含量,以分析和探讨水温影响文昌鱼生殖活动的内分泌机制。结果表明:低温有利于文昌鱼性腺向雌性分化,雌雄比例为4.2:1,中温和高温组则不受影响,雌雄数量大致相等。高水温则有利于文昌鱼的精巢发育和生精活动。28℃海水适于文昌鱼的产卵和排精。根据免疫组织化学和磁酶免定量测定的结果分析提示,温度影响文昌鱼性别分化和发育以及繁殖活动的内分泌机制是:首先水温经皮肤或哈氏窝化学感受器,刺激神经系统(脑泡)释放GnRH。然后GnRH促进哈氏窝分泌LH,从而可能刺激性腺产生和分泌性类固醇激素,始动文昌鱼性腺的发育至成熟及其生殖活动。此外,脑中芳香化酶可能介导文昌鱼性别分化。     

利用引物退火控制技术克隆日本囊对虾性腺差异表达基因

为了解日本囊对虾（Marsupenaeusjaponicus）性腺发育及分化的分子机制,本研究采用改良的引物退火控制技术克隆到了共8个精巢、卵巢的差异表达基因．其中4个为已知基因,分别为凝血酶敏感蛋白基因、皮质棒蛋白基因、增殖细胞核抗原基因和泛素缀合酶基因;4个为未知基因,分别命名为MjACP3-T、MjACP4一T、MjACPl5一T和MjACP4一O基因．采用实时定量PCR方法分析了4个未知基因在性腺发育过程的表达谱,结果表明：MjACP3一T、MjACP4．T和MjACPl5,T基因在日本囊对虾精巢和卵巢中的表达量有显著差异,且在各个时期精巢的表达量均高于卵巢,说明这3个基因可能在精巢的发育中起到某些重要作用．卵巢MjACP4一O基因的表达量变化较大,第5期卵巢的相对表达量达到最高（为1．38）,而其他各个阶段的变化较大,在第4期卵巢的相对表达量最低（为0．03）．在精巢中,MjACP4一O基因的表达量随着精巢逐渐发育成熟呈下降趋势．定量PCR结果与引物退火控制技术的结果有着很好的一致性．研究结果表明,引物退火控制技术是一种简单高效的克隆差异表达基因的技术．采用该技术所克隆到的8个精巢、卵巢的差异表达基因,为进一步了解日本囊对虾性腺发育分化的分子机制提供了基础材料．     

翡翠贻贝CYP4基因克隆及其表达水平分析

利用简并引物PCR以及cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得了总长度为1197bp的翡翠贻贝Perna viridis CYP4基因cDNA序列.根据所获得的翡翠贻贝cDNA序列设计定量PCR引物,利用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR)技术测定了CYP4基因在野生翡翠贻贝消化腺、足和性腺中的表达水平.此外,本研究还应用实时荧光定量PCR技术对经过Aroclor1254暴露处理对翡翠贻贝性腺中CYP4表达水平的影响进行了定量测定.研究结果表明,CYP4基因在野生翡翠贻贝消化腺、足和性腺中均有表达,且其表达水平具有组织差异和性别差异;Aroclor1254暴露处理对翡翠贻贝性腺CYP4基因的表达水平有明显的诱导作用,并且这种诱导作用有明显的时间和剂量效应.本研究为CYP4基因作为生物大分子标记物在环境监测领域的应用提供了分子生物学水平的支持.     

光唇鱼(Acrossocheilus fasciatus)Leptin基因克隆及禁食-再投喂对其表达的影响

瘦素(Leptin)是在动物摄食和能量代谢调节中具有重要作用的一种蛋白。为研究光唇鱼(Acrossocheilus fasciatus)中Leptin基因(AfLep)的结构和功能,作者克隆了其c DNA序列全长。结果显示AfLep由1315个核苷酸组成,含1个长度为516bp的开放阅读框,预测编码蛋白由171个氨基酸残基组成并具有长度为20aa的信号肽。系统进化树中AfLep与其他鲤科鱼类的Leptin蛋白聚为一簇,与齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)进化相关性最高。多重序列比对显示AfLep与齐口裂腹鱼Leptin蛋白相似性最高(86.7%),与鲤科其他鱼类间的相似性均在80%以上。AfLep具有脊椎动物Leptin蛋白的4个保守?螺旋结构,其三级结构与人Leptin相似。AfLep在光唇鱼肝脏中的表达量最高,其次是脑和肾,其他组织中仅有微弱表达。实时荧光定量PCR检测显示禁食后光唇鱼肝脏AfLep表达量降低(P0.05),禁食1d、3d、7d时的表达量分别比与禁食前降低了58.25%、73.82%和92.05%;禁食1d和3d的鱼经再投喂后肝脏AfLep表达量均显著升高(P0.05),但禁食7d的鱼再投喂后AfLep表达量仅略有升高(P0.05)。上述结果表明AfLep参与了光唇鱼的摄食管理和能量代谢调控。