钝顶节旋藻别藻蓝蛋白基因克隆、分析及重组表达蛋白荧光活性的研究

为探究蓝藻藻胆体核心色素蛋白-别藻蓝蛋白单个亚基的光学活性和功能,本研究克隆了钝顶节旋藻(Arthrospira platensis FACHB314)中的脱辅基别藻蓝蛋白基因apcAB及其亚基基因apcA和apcB。节旋藻基因组中apcAB全长共1 056 bp,由apcA和apcB串联组成,中间间隔84 bp。其中,apcA和apcB基因的全长均为486 bp,且均编码161个氨基酸,预测分子量分别约为17.39和17.33 kDa,它们分别编码的α和β亚基均属于Globin＿like超级家族,系统进化树分析显示其氨基酸序列在蓝藻和节旋藻中较为保守。将克隆出的亚基基因apcA、apcB分别同前期A.platensis FACHB314中获得的藻蓝胆素合成相关基因ho和pcyA以及色基裂合酶基因(cpcE、cpcF、cpcU、cpcS、cpcT)共同转化至大肠杆菌中,获得重组别藻蓝蛋白亚基菌株E.coli HPEFUSTA、E.coli HPEFUSTB。SDS-PAGE和Western Blot均显示重组菌株中已成功表达别藻蓝蛋白单亚基。荧光检测结果显示,在600 nm波长激发下,...     

华北半叶紫菜藻胆体的光谱特性和光能传递的研究

红藻的光合器是由叶绿体和藻胆体组成的。藻胆体由多种藻胆蛋白和在结构上起连接作用的无色蛋白或多肽所组成。藻胆体与类囊体片层紧密结合,在单位类囊体的片层上藻胆体的数目因生物种类不同及其所处环境条件的不同而异;一般为400—1200个/μm~(-2)。 藻胆体的功能是捕获光能和将光能传递给类囊体片层上叶绿素a,以进行光合作用。 红藻藻胆体中藻胆蛋白之间光能传递顺序为:R-藻红蛋白→R-藻蓝蛋白→别藻蓝     

具荧光活性的节旋藻藻蓝蛋白α亚基在大肠杆菌中的重组表达

为探索节旋藻藻蓝蛋白的生物合成机理,以钝顶节旋藻(Arthrospira platensisFACHB314)基因组DNA为模板克隆了藻蓝蛋白α亚基基因cpcA、催化脱辅基蛋白与色基结合的裂合酶基因cpcE和cpcF,以及催化色基合成的铁氧蛋白氧化还原酶基因pcyA;以Synechocystissp.PCC6803基因组DNA为模板克隆了亚铁血红素氧化酶基因hox1。然后分别将cpcA、cpcE和cpcF基因构建到质粒pACYCDuet-1中,将hox1和pcyA基因构建到质粒pET-24a(+)中,用电击法将二者共同转化E.coliBL21(DE3),经诱导表达得到具有荧光活性的节旋藻藻蓝蛋白α亚基。在590 nm激发波长下,荧光发射峰为637.8 nm,证实了节旋藻自身的裂合酶CpcE和CpcF能够催化色基PCB与藻蓝蛋白脱辅基结合产生有荧光活性的藻蓝蛋白α亚基,为表达有荧光活性的藻蓝蛋白提供理论和实验基础。     

重组藻胆蛋白与高等植物类囊体膜之间能量传递的研究

为了探究藻胆蛋白与高等植物类囊体膜之间的光能传递规律,验证重组藻胆蛋白是否可以与高等植物类囊体膜之间的光能传递,本研究分别提取了重组藻红蛋白、重组藻蓝蛋白以及菠菜和韭菜的类囊体进行混合孵育,然后进行了全波长吸收光谱以及荧光光谱检测。结果显示:混合孵育时间为10~20 min有利于重组藻红蛋白和藻蓝蛋白与类囊体膜结合并进行光能传递,最适混合孵育时间随重组藻胆蛋白和类囊体的种类不同而稍有不同;重组藻红蛋白不能与菠菜或韭菜的类囊体膜直接发生光能传递,但是当体系中添加重组藻蓝蛋白的时候就可以;重组藻蓝蛋白可以与类囊体中的叶绿素a直接进行光能传递,使得叶绿素a的荧光发射峰值显著提升,当藻红蛋白和藻蓝蛋白的比例是1∶2时,光能传递效率较高。本研究为藻胆蛋白在构建新型光合系统中的应用提供实验依据。     

光学活性藻蓝蛋白β亚基的体内重组

在Synechococcus sp.PCC 7002中,首先发现了特异性催化脱辅基藻蓝蛋白β亚基(153位)与藻蓝胆素(phycocyanobiling, PCB)连接的裂合酶基因cpcT.本实验在Synechocystis sp.PCC 6803中找到与cpcT具有高度同源性的基因slr1649.构建2组相容的重组质粒pCDF-cpcB(C82I)或(C153I)-ho1-pcyA和pRSF-slr1649,cpcB(C82I)和cpcB(C153I)分别编码82和153位被突变的脱辅基藻蓝蛋白β亚基,slr1649编码可能的特异性裂合酶,在大肠杆菌体内生成PCB必需的2个基因(ho1编码血红素氧化酶,pcyA编码藻蓝胆素合成酶),将这些基因共同转化到大肠杆菌诱导表达,利用亲和层析柱对可溶性蛋白进行纯化,产物进行SDS-PAGE、色素蛋白锌电泳和光谱检测.结果表明基因slr1649能够特异性催化CpcB(153位)与PCB的连接,产生了具有光学活性的CpcB(C82I)-PCB,为进一步研究螺旋藻藻蓝蛋白的生物活性奠定了基础.     

藻胆蛋白 与绿藻光合膜之间的激发能传递

研究了藻胆蛋白与绿藻光合膜之间激发能传递的关系.发现只有在别藻蓝蛋白存在时,藻红蛋白或藻蓝蛋白才能将其所吸收的光能传递给一起温育的绿藻类囊体光系统Ⅱ.传能效率与藻胆蛋白的种类有关.藻胆蛋白只能将激发能传递给经SDS-PAGE纯化的LHCⅡ,但不能传递给D₂蛋白.     

重组藻蓝蛋白与水稻类囊体膜之间光能传递的初步研究

为了研究藻蓝蛋白和高等植物类囊体膜之间的光能传递,本实验将诱导表达的重组藻蓝蛋白和水稻类囊体混合孵育后,检测其77K荧光发射光谱以及类囊体膜的电子传递速率和光化学量子产量,结果表明重组藻蓝蛋白和水稻类囊体膜光系统Ⅰ之间存在能量传递使得光化学量子产量提高.本研究为利用藻胆蛋白构建新型光合系统提供了理论基础和实验依据.     

坛紫菜藻红蛋白α,β亚基基因的克隆和序列分析

藻胆蛋白(Phycobiliprotein,PBP)是原核藻类和真核藻类进行光合作用的捕光色素蛋白,占藻体干重的2%左右,主要分为3类:藻红蛋白(phycoer-ythrin,PE)、藻蓝蛋白(phycocyanin,PC)和别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)[1].藻胆蛋白一般由α亚基和β亚基组成,部分藻胆蛋白中还存在γ亚基.一般由α和β亚基形成稳定的单体(αβ),再由单体聚合为多聚体(αβ)_n.从蓝藻和红藻中分离的藻胆蛋白为三聚体(αβ)₃或六聚体(αβ)₆[2].     

别藻蓝蛋白基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达

采用亚克隆方法,将别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)基因插入到毕赤酵母整合型表达载体pPIC6αA中,再用SacⅠ线性化,纯化后,用氯化锂法转化毕赤酵母菌株X-33,筛选表达APC的重组子。PCR和序列分析表明,APC基因已整合到酵母染色体中。重组子经甲醇诱导,用Western blotting在培养基上清液检测到APC,表明别藻蓝蛋白(APC)在毕赤酵母中可以表达。APC由两种亚基组成,分子量分别为19kDa和21kDa。重组子经摇瓶培养48h表达量达4.4mg/L。     

藻红蛋白研究进展

高等植物的主要光合色素是叶绿素a和叶绿素b,而红藻、蓝藻和隐藻的光合色素是叶绿素a和藻胆蛋白。藻胆蛋白包括藻红蛋白(Phycoerythrin,PE)、藻蓝蛋白(Phycocyanin,PC)、异藻蓝蛋白(Allophy-cocyanin,APC)和藻红蓝蛋白(Phycoerythrocyanin,PEC)等,氨基酸序列和免疫交叉反应结果显示PEC归于PC之中。它们各有自己独特的吸收光谱和荧光发射光谱。PE,PC,APC在藻体类囊体膜上顺序排列,加上连接蛋白构成藻胆体,其结构如图1所示。藻胆蛋白能高效率地捕获光能并传递给光系统,光能传递的方向为PE→PC→APC→chla。对藻胆蛋白结构与功能…     

隐藻藻蓝蛋白与类囊体膜的动态结合模型

隐藻藻胆蛋白在类囊体腔中的存在状态始终存在争议,为了深入了解这一问题,作者以含有藻蓝蛋白(PC645)的蓝隐藻(Chroomonas placoidea)活体细胞及充分洗涤过的类囊体膜为材料,测定其室温吸收光谱、荧光谱以及77K低温荧光光谱,并根据光谱数据分析了PC在类囊体腔中的存在状态。结果显示,蓝隐藻的类囊体膜上始终紧密结合着一定量的PC,并且很可能是以PC的β亚基与膜相接触,证实藻胆蛋白在类囊体腔中不是完全游离的,与膜的接触也并非完全无倾向性排布;PC既可将激发能传递给光系统(PS)II,但也可传递给PSI,相较于叶绿素(Chl)a和Chl c,在PSI长波荧光中PC的贡献更明显,而Chl c吸收的光能,更倾向于传递给PSII或者短波长Chl a;蓝隐藻细胞中表现出超比例的PC荧光发射,说明除了结合在膜上的PC外,有一部分PC是游离的,其存在对于隐藻捕光功能来说可能是有冗余的;游离的PC可与类囊体膜重新接触而恢复能量传递功能。根据实验结果以及前人的报道,提出了隐藻藻胆蛋白与类囊体膜的结合是动态的观点,并给出了相应的模型。     

江蓠属藻胆蛋白的研究──Ⅱ.龙须菜藻胆蛋白光谱特性和荧光动力学研究

本文以野生型和突变型龙须菜为材料,测定了完整藻体的室温吸收光谱、77K低温荧光发射光谱和叶绿素诱导荧光动力学曲线.野生型(Wt)和黄色突变体(Ye100)的室温吸收光谱有435、498、540、566、618、640和680nm7个吸收峰;绿色突变体Gr180和Gr184则只有除540nm以外的6个吸收峰.3种突变体的藻红蛋白含量均比野生型少,两种绿色突变体的藻蓝蛋白含量相对有所增加,别藻蓝蛋白含量变化不明显.77K低温荧光发射发谱(激发光分别为436、540和580nm)的结果表明:在发射峰的波长上,4种材料没有明显的区别,但Wt中PE吸收的光能传递效率比较低.叶绿素诱导荧光动力学曲线显示Wt的光系统Ⅱ活性、光系统Ⅱ原初光能转化效率及光合碳代谢活性都高于突变体.     

坛紫菜R-藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白的亚基组成和发色团含量

坛紫菜(Porphyra haitanensis T.J.Chang et B.F.Zheng)中的R-藻蓝蛋白在Bio-Rex 70柱上用脲溶液(pH3.0)解离和层析,得到了α和β两个亚基,用SDS-PAGE测定α和β亚基的分子量分别为18 400和20 500。变藻蓝蛋白的α和β两亚基均分子量经测定,分别为18 800和19 700。R-藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白的分子量分别确定为117 000和112 000,两藻胆蛋白中α和β两个亚基的摩尔比都为1:1,确定两藻胆蛋白的亚基组成都为(αβ)_3。各亚基的发色团含量为:R-藻蓝蛋白中,α亚基含1个藻蓝胆素,β亚基含1个藻蓝胆素和1个藻红胆素。变藻蓝蛋白中,α和β亚基各含1个藻蓝胆素。     

几种重组别藻蓝蛋白的抗氧化活性

藻胆蛋白是某些藻类特有的捕光色素蛋白,其中天然别藻蓝蛋白、藻蓝蛋白的抗氧化活性已经被证明。实验以2,2-盐酸脒基丙烷(AAPH)为自由基生成者,应用藏红花素退色反应为检测清除氢过氧自由基的方法,探讨了在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达并纯化的带有6×His(6×组氨酸)标签和带有麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的重组别藻蓝蛋白及其α、β亚基的抗氧化活性。结果表明,带有His标签的6×Hisα-APC、6×Hisβ-APC和6×His-APC均显示出一定的清除氢过氧自由基的能力,其中6×Hisβ-APC清除氢过氧自由基的IC50值可达到27.2 mg/L,Ka/Kc(氢过氧自由基与重组别藻蓝蛋白和藏红花素反应的速度常数比)达到1.24,大于带有色素基团的天然APC清除氢过氧自由基能力(IC5057.5 mg/L);而带有MBP标签的重组别藻蓝蛋白亚基MBPα-APC和MBPβ-APC和MBP-APC(rAPC)则无明显的清除能力。结果首次证实了脱辅基蛋白具有清除氢过氧自由基能力,因而在天然藻胆蛋白中脱辅基蛋白是清除自由基的贡献者之一,这为进一步研究重组别藻蓝蛋白的抗肿瘤机理提供了线索。     

中国西沙群岛底栖甲藻热带库里亚藻(Coolia tropicalis)的形态学、系统发育及毒性研究

库里亚藻(Coolia)是一类广泛分布且具有生物毒性的海洋底栖甲藻。本研究对近年来在中国南海西沙群岛海域采集分离的4株库里亚藻, 通过光镜及电镜下的形态学观察, 并结合基于核糖体大亚基(large subunit, LSU)rDNA(D1-D3)和内部转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)的序列进行系统发育分析, 鉴定该4个株系为热带库里亚藻(Coolia tropicalis)。在卤虫(Artemia salina)生物毒性试验中, 热带库里亚藻不同株系毒素提取液对卤虫幼虫表现出了毒性差异, XS554株系的48h半致死浓度(LC50)为1.42mg·mL ^-1(约相当于1.1×10 ⁵cells·mL ^-1), 5XS15株系的LC50为1.92mg·mL ^-1(约相当于1×10 ⁵cells·mL ^-1)。     

雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因在莱茵衣藻叶绿体中的表达

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的β-胡萝卜素酮化酶是虾青素生物合成途径中关键酶之一,本研究通过基因枪法将克隆出的β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt),转入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的叶绿体中,经过含100mg/L壮观霉素固体培养基筛选得到转化子。通过PCR和基因组酶切Southern杂交分析,证明bkt基因通过同源重组定点整合到转化子的叶绿体基因组中。进一步通过RT-PCR和RT-PCR Southern杂交分析,表明bkt在衣藻转化子中得到表达。     

养殖密度对银鲳幼鱼生长、代谢酶活力及其相关基因表达的影响

采用为期40d的饲养试验, 探讨养殖密度(30尾·m^-3、60尾·m^-3和90尾·m^-3)对初始平均体质量为(3.88±0.72)g的银鲳幼鱼生长、肝脏和肾脏中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)的酶活力以及相应基因mRNA表达的影响。结果显示: 1) 60尾·m^-3组银鲳幼鱼的增重率和特定生长率分别为(235.19±10.23)%和(4.03±0.10)%, 显著高于30尾·m^-3组(p<0.05), 而与90尾·m^-3组无显著性差异(p>0.05); 2) 90尾·m^-3组银鲳幼鱼的酶活力变化最显著, 30尾·m^-3组的变化幅度最小, 60尾·m^-3组介于两者之间; 3) 肝脏和肾脏中LDH、ALT、AST酶活力均呈先升高后降低的趋势, 其中肝脏中LDH、ALT、AST酶活力高峰分别出现在6h、10d和10d, 是初始值的2倍、4.3倍和2倍, 肾脏中3种酶活力峰值则分别出现在1d、3d和5d, 是初始值的2.1倍、2.2倍和3.1倍; 4) AST、ALT、LDH等3种酶基因mRNA表达量变化规律与各自酶活力变化规律一致。综上所述, 养殖密度60尾·m^-3时可促进银鲳幼鱼生长, 90尾·m^-3高密度养殖会导致银鲳幼鱼额外能量的需求增加, 糖异生相关基因mRNA表达量上调使肝脏、肾脏中AST、ALT、LDH酶活力显著升高, 最终出现生长变慢的情况。     

利用多功能裂合酶CpcE/F合成非天然重组藻胆蛋白

藻胆蛋白裂合酶是催化藻胆色素与脱辅基藻胆蛋白亚基共价连接的裂合酶,在藻胆蛋白的生物合成途径中发挥着重要作用。本实验以藻蓝蛋白裂合酶Cpc E/F为研究对象,采用基因工程组合表达技术,构建了pCDFDuet-apcA-cpcE/F-hox1-pebS、pCDFDuet-pecA-cpcE/F-hox1-pebS等重组质粒,并导入大肠杆菌中,在IPTG的诱导下,成功表达得到两种非天然藻胆蛋白ApcA-PEB和PecA-PEB,这表明Cpc E/F不仅可以催化藻蓝胆素和脱辅基藻蓝蛋白的结合,还可以催化藻红胆素(PEB)与别藻蓝蛋白α-亚基(ApcA)和藻红蓝蛋白α-亚基(PecA)的结合,因此是一种多功能的裂合酶。根据重组产物的光谱特征峰分析发现,ApcA-PEB和PecA-PEB作为两种非天然存在的重组藻胆蛋白,具有与对应天然藻胆蛋白有着相近的特征吸收光谱和荧光发射峰,但同时具有明显的波长偏移并伴有色素异化现象,其光谱学性质主要由其所携带的色素基团决定。另外,荧光寿命衰减分析发现,不同脱辅基蛋白对于重组藻胆蛋白的光谱稳定性具有重要的影响。     

海洋链霉菌分离株M095遗传转化体系的建立

研究了海洋链霉菌分离株M095的基因转移系统。利用属间接合转移将具有oriT的大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pIJ8600转入EscherichiacoliET12567(pUZ8002)中,获得供体菌。将供体菌与预萌发的菌株M095的孢子进行接合转移,将质粒pIJ8600转入菌株M095中,其转化率为1.99×10-4个接合转化子/受体。Southern杂交证明质粒pIJ8600已经整合到菌株M095的染色体上。同时,将来自Spirulinamaxima(Cyanophyta)的别藻蓝蛋白基因(apc)克隆在质粒pIJ8600的XbaI和BglII位点,产生质粒pAPIJ。用接合转移法将质粒pAPIJ转入菌株M095。通过SDS-PAGE分析,得到2个大小为22ku和17ku的蛋白,分别相对应于别藻蓝蛋白的α和β亚基。这些结果进一步证明菌株M095的遗传转化体系已经成功建立起来,这将为其他海洋放线菌遗传转化工作的研究奠定基础。     

国家自然保护区海岛森林碳汇潜力评估及驱动因素分析

海岛森林生态系统受地理位置特殊和数据源较少等因素影响,其碳通量动态监测及碳汇功能评估鲜见报道。该文以南麂岛森林生态系统为研究对象,基于涡度相关技术探讨了2020—2021年净生态系统碳生产力(net ecosystem productivity, NEP)、总初级生产力(gross primary productivity, GPP)和生态系统呼吸(ecosystem respiration, Reco)的变化特征及其影响因素。结果显示,南麂岛森林生态系统表现为碳吸收,2020和2021年CO₂净吸收量分别为516 g C·m^-2·a^-1和598 g C·m^-2·a^-1,Reco分别为1 037 g C·m^-2·a^-1和1 646 g C·m^-2·a^-1,GPP分别为1 552 g C·m^-2·a^-1和2 244 g C·m^-2