浴场海水中大肠杆菌耐药性及其耐药基因研究

为了解海水浴场中大肠杆菌耐药性状况及其耐药基因分布,以大连星海浴场近岸海水样品为研究对象,分离鉴定得到41株大肠杆菌,采用K-B药敏纸片法检测其对9种常用抗生素的耐药性,并对耐药菌株中的耐药基因进行检测。结果表明:41株受试大肠杆菌菌株对四环素的耐药率最高(46%),而对氨曲南的耐药率最低(5%),大肠杆菌的多重耐药率达到34%。采用PCR方法对41株分离菌株进行四环素耐药基因检测,结果显示,仅四环素耐药基因tetA和tetB被检出,其他4种类型四环素耐药基因未被检出。大肠杆菌基因组与质粒DNA中tetA的检出率分别为34%和29%;tetB的检出率分别为2%和12%。相关性分析结果表明大肠杆菌的四环素耐药表型与四环素耐药基因的阳性检出率显著相关。     

东海温州水域4类常见耐药基因的流行情况研究

磺胺类、四环素、喹诺酮类和多粘菌素抗生素是医学与养殖业中的常用抗生素,其中多粘菌素在畜牧养殖业中常作为促长剂添加。调查分析了这4类抗生素的常见耐药基因在东海温州近海水域的分布情况。利用抗性平板筛选温州近海水域对磺胺类、四环素类及喹诺酮类抗生素耐药的可培养细菌分离株,对耐药分离株通过PCR方法进行目标耐药基因检测;对目标耐药基因阳性的耐药分离株进行多粘菌素耐药基因MCR检测以及采用微量二倍稀释法测定对上述4类抗生素的耐药性。结果表明,利用抗性平板筛选获得可培养耐药分离株1 605株,从中筛选到目标耐药基因阳性的51株,检出率为3.18%,包括含磺胺类耐药基因35株、含四环素耐药基因36株、含喹诺酮耐药基因17株、含多粘菌素耐药基因2株; 51株耐药菌归于7个菌属,其中气单胞菌属(Aeromonas sp.) 43株,占比84.31%,枸橼酸杆菌属(Citrobacter sp.)和希瓦氏菌属(Shewanella sp.)各2株,埃希氏菌属(Escherichia sp.)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)、Thalassobius sp.及Amphritea sp.各1株;上述2株非常见分离株不统计在内,常见的49株均对四环素耐药, 41株对多粘菌素耐药,对磺胺类和喹诺酮类耐药的分离株均为34株;同时,发现23株对4类抗生素均产生耐药, 16株对多达3种抗生素耐药,多重耐药现象普遍存在。同时,鉴定出MCR-3阳性的条件致病菌维氏气单胞菌和豚鼠气单胞菌各1株。综上,温州市近海水域中含有常见耐药基因的耐药分离株检出率较低,但同一耐药基因的细菌分布多样,对磺胺类、四环素类、喹诺酮类及多粘菌素类等4类抗生素表现出较强的耐药性,多重耐药现象明显。研究结果将为评估温州近海水域的细菌耐药性风险,规范抗生素的使用提供科学依据。     

恩诺沙星、磺胺嘧啶和呋喃西林对共培养的萱藻丝状体和膨胀色球藻生长的影响

为有效抑制萱藻种质保存和丝状体扩增时膨胀色球藻的污染,本实验应用实验生态学法,研究了恩诺沙星、磺胺嘧啶和呋喃西林3种抗菌药对共培养的萱藻丝状体和膨胀色球藻生长的影响.结果显示:在5～100 mg/L范围内,50 mg/L恩诺沙星适于除去萱藻种质保存或丝状体扩增过程中出现的膨胀色球藻,实验第18 d膨胀色球藻的日均增长率...     

牡蛎体内及其养殖水体中细菌耐药性研究

为进一步了解牡蛎体内外细菌的耐药性，对分离自阳江的香港牡蛎（Crassostrea hongkongensis）养殖水体及其内脏团的637个异养细菌进行了10种抗生素的药敏试验。采用纸片扩散法（Kirby-Bauer，简称K-B），参照NCCLS抗生素敏感试验操作标准，研究细菌的耐药概况。结果显示：健康牡蛎体内细菌对恩诺沙星和庆大霉素耐药率较低，发病牡蛎体内细菌对庆大霉素耐药率最低，次之为复合磺胺和恩诺沙星；水体细菌对氯霉素、恩诺沙星、环丙沙星耐药率较低，水体及体内细菌对呋喃唑酮耐药率最高，而对卡那霉素及青霉素耐药率则波动较大。结果还显示，不同来源的受试菌株多重耐药状况严重，来源于健康和病牡蛎的菌株在7月份的多重耐药率达到峰值，分别为66.7%和64.3%，养殖水体细菌多重耐药率峰值出现在4月份，最高达76.7%。总体来看，源于牡蛎养殖环境水体及其牡蛎体内的异养菌多重耐药比例较高，值得引起注意。而受试菌株对不同药物的抗性存在较大差异，且异养细菌对呋喃唑酮的耐药率明显高于对其它受测抗生素的耐药率。从时间动态上看，水体菌耐药率峰值出现于4月份，而牡蛎体内菌群耐药率峰值出现于7月份。     

三沙湾大肠杆菌和肠球菌抗生素耐药性分析

为探究三沙湾水域细菌耐药性的情况,本文分离了该海域11株大肠杆菌和12株肠球菌,并测定其对常见抗生素的耐药性以及相关耐药基因。结果显示:大肠杆菌对抗生素的耐药率从高到低为四环素=氨苄西林>氯霉素=头孢唑啉>头孢噻肟=呋喃妥因>庆大霉素>环丙沙星,其中大肠杆菌对氨苄西林存在明显的高水平耐药(MIC≥256μg/mL占36.36%), TEM基因可能是导致耐药的主要基因。肠球菌对抗生素的耐药率从高到低为利福平>呋喃妥因>红霉素>氨苄西林=氯霉素=万古霉素,其对呋喃妥因存在明显的高水平耐药(MIC≥128μg/mL占74.93%)。肠球菌中仅检出喹诺酮类耐药基因gyra和四环素类耐药基因tetM、tetG。该海区存在着明显的多重耐药现象,大肠杆菌和肠球菌的多重耐药率分别达到54.55%和100%,表明三沙湾海域可能存在较为严重的抗生素耐药菌与耐药基因污染。     

异育银鲫(Carassius auratus gibelio)源醋酸钙不动杆菌表型及分子鉴定

采用常规的培养特征、理化特性及分子生物学的方法,对从濒死异育银鲫(Carassius auratus gibelio)血液中分离到的菌株SY-1进行了致病性、表型生物学、分子生物学及药敏试验的系统研究。结果表明,该菌株在盐度5—30、pH6—8,温度10—42℃的LB液体培养基中均能生长,具有脲酶。该菌株16SrRNA基因序列(Gen Bank登录存取号:JX164201,长度1435bp)与其它不动杆菌属菌的16SrRNA基因同源性相似性在99%—100%之间,构建系统发育树确定该菌株为醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)。人工回感可导致异育银鲫死亡。药敏试验结果显示:对恩诺沙星、强力霉素、萘啶酸、复方新诺明、氧氟沙星等10种抗生素敏感;对羧苄青霉素、诺氟沙星、大观霉素、卡那霉素、四环素等14种抗生素中度敏感;对氨苄西林、苯唑西林、林可霉素、万古霉素、氟苯尼考等15种抗生素耐药。     

海水养殖鱼类鳗弧菌(Vibrio anguillarum)临床分离株的血清型和抗生素耐药谱

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是常见的海水鱼类病原菌,有23种血清型,其中O1—O3为主要的致病血清型。我国海水养殖鱼类鳗弧菌的血清型种类尚未明确。本研究对实验室分离和收集自海水养殖鱼类的31株鳗弧菌临床菌株进行了生理生化、16S r RNA基因序列、血清分型、抗生素敏感性的分析,旨在系统了解存在于我国海水养殖环境的鳗弧菌血清学型及耐药特征。首先用API ID32E生化反应鉴定系统对鳗弧菌进行生理生化鉴定,结果未能将待测菌株鉴定到种的水平;然后测定鳗弧菌的16S r RNA基因序列并构建系统发育树,结果显示所有分离株聚为一簇,与鳗弧菌有最近的亲缘关系(相似性99%—100%),据此可将临床菌株鉴定为鳗弧菌。以鳗弧菌O1—O5血清型标准菌株为O抗原制备兔抗血清,采用玻片凝集反应对鳗弧菌菌株进行血清学分析,结果显示属于O1、O2、O3、O5血清型菌株分别有16、5、3、1株,表明我国海水鱼类养殖存在3种血清型的致病性鳗弧菌,O1为主要流行的血清型。用ATB药敏检测系统检测鳗弧菌对28种抗生素的敏感性,结果显示菌株对7种抗生素(林可霉素、夫西地酸、甲硝唑、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、苯唑西林、青霉素)的耐药率为100%,对3种抗生素(红霉素、原始霉素、泰洛星)的耐药率为94.4%(34株),有83%以上的菌株(30株)对12种以上的抗生素产生耐药,表明我国海水鱼类养殖鳗弧菌普遍存在多重耐药性。研究结果为进一步揭示鳗弧菌的流行病学规律和防控弧菌病奠定了良好的基础。     

一株大口黑鲈源ST-873型肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的分离鉴定及生物学特性研究

从患腹水病大口黑鲈(Micropterus salmoides)的头肾、脾脏、肝脏组织中分离到一株优势菌,生长出圆形、边缘整齐的灰白色黏液状菌落;染色镜检可见短粗、卵圆形、有荚膜的革兰氏阴性杆菌。结合形态、生理生化特征、16S rRNA基因序列分析鉴定为肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae),MLST分析进一步确定其为ST-873型,与ST-65型聚为一支;该菌株携带aere、alls、wca和ybt四种毒力基因,具有溶血活性;人工感染大口黑鲈,发现患病鱼呈现腹水等与自然发病类似的症状,且病鱼内脏的分离菌株与攻毒菌株相同;经统计,其LD50为3.4×10⁷ CFU/mL,具有中等生物被膜形成能力。耐药性分析结果显示,该菌株携带bla-shv、sul2、aadA和tetB四种耐药基因,对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、黏菌素类药物敏感,对四环素类、磺胺类、林可酰胺类、利福霉素类耐药;中药三七、款冬花对分离菌株有明显抑制作用。研究探明了大口黑鲈腹水病的主要病原,可为鱼源肺炎克雷伯菌的诊断和防治提供科学依据和数据参考。     

皱纹盘鲍脓疱病病原菌──河流弧菌-Ⅱ的抗药机制的初步研究

1993年9月至1995年末，大连地区的一龄鲍至成鲍都出现了脓疱病，用常规方法从3个养殖厂的病鲍中分离到了3个菌株，分别为D株、N株和T株。经鉴定这3个菌株为同一种──河流弧菌-Ⅱ。这3个菌株来自3个不同的海区、不同的单位，并且这3个单位使用的抗生素种类和浓度也木同，所以这3个菌株对18种抗生素的敏感度也木同。D株对环丙沙星（抑菌坏直径30mm）、复方新诺明（抑菌坏直径27mm）等敏感，而对青霉素、青霉素Ⅱ、氨苄青霉素（抑菌环直径0mm）等耐药。N株除对青霉素Ⅱ、白霉素、吡哌酸等耐药外，对其它12种抗生素都敏感或中度敏感（抑菌环直径13．5－30mm）。T株对氟派酸（抑菌环直径22mm）、环丙沙星（抑菌环直径20．3mm）等敏感，而对氯霉素、复方新诺明等耐药。研究发现，经常使用同一种抗生素很容易使病原菌产生耐药性．连续3d使用单一的抗生素（青霉素）就会产生耐药的菌株。为证明上述3个菌株的抗药性是属于哪一类，以T株为例，提取总DNA，并对总DNA进行EcoRⅠ酶切图谱分析，图谱有明显的异同，说明3个菌株的抗药性不同可能与基因突变有关。不管是非遗传型还是遗传型，都是由于抗生素为细菌提供了耐药突变株的选择环境，从而使耐药菌株得以大量繁殖。     

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)致病性豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)的分离鉴定及其特性分析

近年来细菌性疾病因病原菌种类繁多、覆盖区域广而影响了其养殖业的健康发展,造成较大的经济损失。从体表具有黑斑、肢体残损症状的罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)肝胰腺组织中分离得到1株病原菌,通过形态学观察、生理生化特性鉴定、16S rRNA序列和特定毒力基因检测鉴定,以及人工回归感染试验和药敏试验分析其致病性和耐药性。结果表明,该菌为豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae),含有aer、lip、gcat、ser和OMPA I等毒力基因;药敏试验显示其对头孢曲松、氯霉素等7种抗生素高度敏感,对恩诺沙星、阿米卡星及复方新诺明3种抗生素中度敏感,对四环素、环丙沙星等10种抗生素具有耐药性;人工回归感染实验表明该菌具有较高的致病性,对罗氏沼虾的半致死浓度为6.54×10⁵ CFU/mL。豚鼠气单胞菌作为水产养殖中的条件性致病菌,研究结果揭示了该菌株的部分生物学特性,有利于丰富豚鼠气单胞菌属的基础数据,同时也为罗氏沼虾养殖过程中的病害防控提供了一定参考依据。     

广东沿海香港牡蛎消化道异养菌统计及其耐药性研究

本研究针对高温时期(6月、9月)广东沿海地区的香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)体内异养细菌总数和弧菌总数进行了深入的调查,并由添加单种抗生素(分别是:庆大霉素、呋喃唑酮、利福平、环丙沙星、恩诺沙星、氯霉素、复方新诺明)的培养基中分离得到310个菌株。进一步采用纸片扩散法(kirby-bauer法)针对常见的抗生素对此310个菌株进行药敏测试,了解不同来源菌株的耐药状况。结果表明310个菌株分属48个不同种属,主要是肠杆菌(Enterobacter)、弧菌(Vibrio)、芽孢杆菌(Bacillus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella)、希瓦氏菌(Shewanella)、不动杆菌(Acinetobacter)、假单胞菌(Pseudomonas)、短波单胞菌(Brevundimonas)、发光杆菌(Photobacterium)、黄杆菌(Tenacibaculum)、盐单胞菌(Halomonas)等。在9月份从牡蛎体内分离的异养细菌比6月份分离的异养细菌高出1～2个数量级(除台山外)。6月份从台山地区牡蛎分离的异养细菌数(2.6×10~6～5.8×10~6 cfu/g)最多,高出其他地区1～3个数量级。药敏测试结果显示牡蛎体内异养细菌对20种抗生素普遍存在抗性,尤其对青霉素、卡拉霉素、呋喃唑酮、阿莫西林、克林霉素及万古霉素表现出较高的耐药率。高温时期(6月、9月)分离的异养菌大多数为多重耐药细菌,其比例分别为84.18%和91.72%。本研究将为牡蛎养殖业的疾病控制以及水产养殖中细菌的耐药状况提供重要参考依据。     

半滑舌鳎病原鳗利斯顿氏菌表型及分子特征研究

2008年12月,江苏赣榆某渔场养殖半滑舌鳎出现大量死亡,症状主要表现为:头部、鳃盖及鳍基出血,尾鳍腐烂,腹腔膨胀并积有大量腹水,部分病鱼肠管脱出肛外。从病鱼肝脏、腹水中分离出大量优势生长的细菌,人工感染试验证明其对半滑舌鳎有较强的致病性。对3株分离菌进行了形态特征、理化特性、胞外酶及溶血素活性等表型生物学性状检验;测定了代表菌株的16S rRNA和gyrB基因序列,分析了16S rRNA和gyrB两种基因序列的同源性,并构建了系统发生树,比较了两种基因对分离菌的鉴定能力;结果表明gyrB基因用于细菌种间鉴定更具优越性;基于16S rRNA和gyrB基因的系统发育学分析表明分离菌与鳗利斯顿氏菌具有高同源性,根据分离菌的表型及分子特征,判定分离菌为利斯顿氏菌属(Listonella MacDonell and Colwell 1986)的鳗利斯顿氏菌[Listonella anguillarum (Bergeman 1909) MacDonell and Colwell 1986]。胞外酶活性及溶血活性检测表明3株分离菌均具有淀粉酶、蛋白酶、卵磷脂酶等胞外酶活性,在含7%家兔脱纤血液营养琼脂培养基上呈β型溶血,PCR检测3株供试菌均可扩增出大小约493 bp的溶血素基因和大小约248bp的金属蛋白酶基因。分离菌的耐药谱测定结果显示,对供试49种抗菌药物中的青霉素G等13种药物耐药,对羧苄青霉素等6种药物存在敏感与耐药的株间差异。     

致病性海洋弧菌对氨基糖苷类药物的耐药传递机制初步研究

随着抗菌药物在水产养殖中用量的增加及混合使用现象的出现，水产病原菌表现出更强的耐药性甚至是多重耐药性，大大增加了水产养殖中细菌性病害防治的难度。细菌耐药性最常见的传递方式是耐药质粒的转移。本研究通过对多个水产致病弧菌质粒上新霉素及卡那霉素的耐药基因aph（3''）-IIa进行检测分析，并利用电穿孔法将筛选得到的3个受试菌株上的质粒分别转入大肠杆菌中，结果从3个转化子中检测到目的基因。进一步的药敏测试结果显示，3个转化子的最小抑菌浓度（MIC值）以及最小杀菌浓度（MBC值）均明显上升。可见，在特定条件下，水生致病性弧菌对氨基糖苷类（新霉素和卡那霉素）的耐药质粒可转移至大肠杆菌并参与介导其耐药性，大大降低了受体菌对新霉素和卡那霉素的敏感性。本研究将为环境弧菌与临床细菌对氨基糖苷类药物的抗性传递研究提供数据基础和参考依据。     

Antibiotic resistance in coliform and faecal coliform bacteria from natural waters and effluents

Coliform and faecal coliform bacteria isolated from potable water supplies (springs and wells), streams, seawater, and effluents were examined for the incidence of antibiotic resistance. More than 40% of the coliform and faecal coliform bacteria isolated from drinking water supplies were resistant to one or more antibiotics. In stream and seawater samples, the incidence was increased to more than 60%, and to more than 70% among faecal coliforms isolated from effluents. Approximately 40% of the isolates resistant to streptomycin or tetra‐cycline were able to transfer their resistance determinants to an antibiotic‐sensitive strain of Escherichia coli within 2 h.

Although the widespread use of antibiotics is perhaps the major selective force favouring the increased incidence of antibiotic‐resistant bacteria, antibiotic‐resistant faecal coliforms may also have a selective advantage in natural waters.     

北部湾养殖牡蛎体内异养细菌数量及其耐药性研究

为了探究北部湾养殖区域香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)体内的异养细菌和弧菌数量及其耐药概况变化, 对不同养殖场牡蛎体内的异养细菌进行分离培养, 并统计其数量, 通过药敏纸片扩散等方法研究了细菌的耐药状况。结果显示: 牡蛎在高死亡率养殖环境中体内的异养细菌[(8.6±0.4)×10⁶CFU·g^-1]和弧菌[(9.5±0.4)×10⁵CFU·g^-1]数量较高, 在中死亡率环境中体内的异养细菌[(6.9±0.2)×10⁶CFU·g^-1]和弧菌[(4.5±0.6)×10⁵CFU·g^-1]数量次之, 在低死亡率养殖环境中体内的异养细菌[(3.3±0.1)×10⁶CFU·g^-1]和弧菌[(2.5±0.6)×10⁵CFU·g^-1]数量最低。耐药细菌主要为革兰氏阴性菌, 对β-内酰胺类(青霉素)、糖肽类(万古霉素)的耐药率较高, 对四环素类(四环素、多西环素)的耐药率次之, 对氨基糖苷类(链霉素、庆大霉素、妥布霉素、新霉素)、大环内酯类(红霉素)、喹诺酮类(诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、恩诺沙星)的耐药率较低。在高死亡率环境中牡蛎体内的多重耐药菌占79.7%, 其耐药谱型(48种)较广; 在中度死亡率环境中牡蛎体内的多重耐药菌占66.2%, 其耐药谱型为30种; 在低死亡率环境中牡蛎体内的多重耐药菌占58.4%, 其耐药谱型为17种。本文探究了牡蛎死亡率与其体内异养细菌数量和细菌耐药性的关系, 结果显示牡蛎在高死亡率环境中体内的耐药细菌数量多、耐药谱型较广, 低死亡率环境中牡蛎体内的耐药细菌数量较少, 异养细菌数量与牡蛎死亡率呈正相关关系, 两者相关系数为0.996。     

水产养殖环境常见四环素类抗生素抗性基因tet（M）的演化及传播的初步分析

利用分子系统学方法分析了20 条水产养殖环境中常见的四环素抗性tet（M）基因的序列特点、多态性及系统发育, 并对其细菌寄主分类、环境介质来源作相关性分析。结果表明, 20 条基因序列有4种单倍型, 其中tet（M）-b 和d 是两种远缘基因型, 而a 和c 则是二者之间的序列变异。系统发育树分成三大分支, tet（M...     

海参、海胆养殖水体中多抗性细菌抗性基因的初步研究

抗药性细菌对生态环境、养殖业以及人类健康构成严重威胁。以大连海参、海胆养殖场多抗性细菌筛选为基础,采用分子生物学手段对40株抗性细菌进行了氯霉素、土霉素及氟氯霉素抗性基因检测,探讨抗药性分子遗传机理,从而为控制抗药性细菌的产生和传播提供研究基础。