凡纳滨对虾遗传多样性研究中AFLP体系的建立

凡纳滨对虾是当今世界公认的重要对虾养殖品种之一,然而良种选育研究仍相对落后,亟需采用分子遗传学手段加以解决.本文以凡纳滨对虾为材料,对预扩增体系、选择性扩增体系中的稀释倍数、dNTP浓度、Taq浓度、Mg2+浓度、引物浓度进行比较,结果表明,300 ng基因组DNA采用5U PstI和5UMseI双酶切4 h,16℃连接过夜,连接产物稀释10倍进行预扩增,预扩增产物稀释50倍进行选择性扩增,能够得到稳定丰富的条带,最终建立了适用于凡纳滨对虾的AFLP反应体系.本研究又进一步应用优化后的AFLP反应体系,从64对选择性扩增引物组合中筛选出12对多态性高的引物组合,便于对凡纳滨对虾基因多态性位点进行分析,从而为凡纳滨对虾的遗传多样性研究奠定基础.     

大泷六线鱼脾脏细胞体外培养的研究

应用植块法,比较大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)脾脏细胞在2种基础培养基和3个胎牛血清浓度下的体外培养效果。根据细胞的迁出、贴壁、细胞种类以及生长状况,得出大泷六线鱼脾脏细胞适宜的体外培养体系为:MEM+15%胎牛血清、pH7.2~7.4、20℃;培养产物由6种细胞组成,其中C型细胞培养120 d以上依然状态良好,并进行了传代培养。培养启动12 d后,C型细胞层上出现造血灶,造血灶细胞最长可以维持50 d以上。本研究为大泷六线鱼脾脏细胞系的构建和脾脏功能的研究奠定了基础。     

环境因子对海州湾及邻近海域大泷六线鱼分布影响的分析

根据2011年在海州湾及其邻近海域进行的5个航次的渔业资源和环境调查数据,分析该海域大泷六线鱼的空间分布特征及其季节变化,运用广义可加模型(GAM)研究时空因子和环境因子对其分布的影响。结果表明:海州湾及其邻近海域的大泷六线鱼主要集中分布于35.0°N~35.6°N,119.6°E~121.2°E海域;7月平均网获质量最高(4 709.19g/h),12月平均网获质量最低(66.92g/h)。大泷六线鱼的空间分布存在明显的季节变化,且主要分布于研究海域的东北部。GAM模型分析表明,底层水温是影响大泷六线鱼空间分布的主要环境因子。模型筛选出的解释变量对大泷六线鱼空间分布的影响从大到小依次为:月份、底层水温、纬度、底层盐度和经度,GAM模型的总偏差解释率为75.32%。     

大泷六线鱼人工繁殖及育苗技术初步研究

总结了2009 ～2010年关于大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)人工繁殖及育苗技术的研究结果,论述了大泷六线鱼苗种繁育的关键技术.通过对亲鱼强化培育和促熟,创新发明人工平面授精技术和网箱吊式孵化技术,加强饵料的合理搭配与投喂、水质调控技术等措施,突破了大泷六线鱼人工繁殖的技术难点,明显提高了受精率、孵化率和苗种成活率,解决了人工繁殖大泷六线鱼苗种生产问题.在水温16～ 17℃,盐度31,光照500 ～ 1000 1x的培育条件下,大泷六线鱼鱼苗经过90 ～ 100 d的培育,全长生长至5 ～6cm.2009和2010年分别培育出全长5 cm以上大泷六线鱼鱼苗4.1万尾、11.4万尾,苗种成活率分别达到41.7％、43.2％,在国内首次实现了大泷六线鱼人工规模化繁育.     

大泷六线鱼的营养成分分析

大泷六线鱼（Ｈｅｘａｇｒａｍｍｏｓ　ｏｔａｋｉｉ）俗称黄鱼,隶属鱼由形目,六线鱼亚目,六线鱼科,六线鱼属,具有耐低温、肉质鲜美等特点,颇受消费者青睐。近年来,由于大量捕钓以及大泷六线鱼本身产卵量少等原因导致其天然资源日渐匮乏,人工养殖业应运兴起。但迄今为止,有关大泷六线鱼的基础生物学研究较少,至于营养化学更未见报道。本实验通过对大泷六线鱼营养成分的测定分析,同时比较测定鳚鱼、杜父鱼的营养成分,并对照其他几种常见的养殖鱼类,初步评定其营养价值,为其营养学研究提供基础性资料并期进一步推广发展其养殖事…     

温度、盐度和两种麻醉剂对大泷六线鱼幼鱼耗氧率、排氨率的影响

采用静水呼吸室法,研究了温度、盐度和两种麻醉剂(丁香油、MS-222)对体质量为(6.44±0.59)g的大泷六线鱼幼鱼耗氧率和排氨率的影响。实验分别设置了5个温度梯度(8℃、12℃、16℃、20℃、24℃),5个盐度梯度(15‰、20‰、25‰、30‰、35‰),6个丁香油浓度梯度(0、8、16、24、32、40 mg/L)和5个MS-222浓度梯度(0、10、20、30、40 mg/L)。结果显示,温度、盐度和两种麻醉剂均对耗氧率和排氨率有显著性影响。8℃时,耗氧率和排氨率最低,随温度升高先升高后降低,且均在20℃时达到峰值;盐度30‰时,耗氧率和排氨率最低,盐度升高或降低都会导致耗氧率和排氨率升高;丁香油和MS-222均能有效降低大泷六线鱼的耗氧率和排氨率,其中丁香油的降低效果更为明显;丁香油浓度为24 mg/L时或MS-222为20 mg/L时可使大泷六线鱼处于深度镇定期,结合耗氧率及排氨率变化,认为上述浓度是大泷六线鱼幼鱼保活运输的最佳浓度;本研究所有处理组的O∶N比值范围均在14.77~24.11之间,表明适宜温度和盐度条件下,大泷六线鱼幼鱼主要由蛋白质和脂肪提供能量。研究认为,适度降温、自然盐度和适宜浓度的麻醉剂处理均可显著降低大泷六线鱼幼鱼的呼吸代谢强度,其中丁香油相比MS-222作用效果更加明显。本研究结果为实现大泷六线鱼高质量运输提供了科学参考。     

大泷六线鱼卵黄原蛋白的纯化鉴定及其ELISA检测方法的建立

海洋环境雌激素污染日益加剧,亟需建立可靠的生物检测技术,鱼类卵黄原蛋白(vitellogenin, Vtg)是国际上推荐的环境雌激素生物标志物。本研究采用凝胶过滤与离子交换层析技术从17β-雌二醇(E_2)肌肉注射后的雄性大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)血浆中纯化获得Vtg。经鉴定大泷六线鱼Vtg是分子量约为340 kDa的糖磷脂蛋白,SDS-PAGE显示其亚基分子量约为170 kDa。利用纯化的Vtg免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗血清,并且Western blot结果证实抗血清对Vtg具有很好的特异性。以纯化的Vtg与兔抗Vtg多克隆抗体建立了检测大泷六线鱼血浆Vtg的间接竞争酶联免疫吸附反应(ELISA)。该检测方法的工作范围为15.62～1 000 ng/mL,组内与组间差异分别为6.85%与6.79%,可用于大泷六线鱼血浆Vtg的准确定量。本研究建立的大泷六线鱼Vtg ELISA具有较高的敏感度、特异性与精确度,为中国海洋环境雌激素的生物监测提供了可靠工具。     

海州湾及邻近海域大泷六线鱼的生长、死亡和最适开捕体长研究

根据2011年海州湾及邻近海域的底拖网调查资料,对大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)的群体结构、体长-体重关系、生长、死亡和资源利用状况进行初步研究。结果表明:大泷六线鱼渔获群体体长范围为44~292mm,优势体长组为54~74mm,平均体长为88mm;体重范围为0.35~574.3g,优势体重组为10g,平均体重为17.94g;体长-体重关系为W=4.23×10-6 L3.31(R2=0.978 6,n=1 514)。应用FiSATⅡ软件中的ELEFANⅠ方法估算的von Bertalanffy生长方程参数L∞、K和t0分别为328mm、0.36a-1和-0.43a;应用FiSAT软件中变换体长渔获曲线法求得总死亡系数Z为2.06,自然死亡系数M和捕捞死亡系数F分别为0.62和1.44,开发率E为0.70。Beverton-Holt单位补充量渔获量模型分析表明,在现行捕捞死亡系数F=1.44、YW/R取最大值时对应的开捕年龄为1.83a。现阶段大泷六线鱼资源已处于过度开发状态,考虑拐点年龄、临界年龄、繁殖和经济效益等综合因素,建议将海州湾大泷六线鱼最适开捕规格定为体长191mm。     

大泷六线鱼全人工繁育技术研究

2012年~2014年,作者在山东省海洋生物研究院鳌山卫中试基地进行了大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)全人工繁育研究,通过人工促熟、激素诱导,培育F1代全人工亲鱼558尾(雄鱼231尾,雌鱼327尾),获得受精卵33.0万粒,孵化F2代仔鱼30.0万尾,受精率98%,孵化率91%。在水温16~17℃、盐度31、p H 7.8~8.1、溶解氧6 mg/L条件下,历时110 d,培育平均全长6.2 cm F2代苗种11.7万尾,苗种成活率39%。作者在国内外首次开展了大泷六线鱼全人工繁育技术研究,丰富了大泷六线鱼养殖基础资料,为大泷六线鱼产业的发展奠定基础。     

山东俚岛人工鱼礁区大泷六线鱼生长、死亡及资源评价

为研究人工鱼礁区大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)生长、死亡和资源利用,本文根据2012—2015年山东俚岛人工鱼礁区与对照区的地笼与三重刺网调查资料,运用ELEFAN I基于体长频率时间序列分析法、变换体长渔获曲线法、单位补充量等渔获量曲线法和生物学参考点等对其群体结构、生长、死亡、资源现状和资源管理进行初步研究,再运用蒙特卡洛模拟法将不确定性分析引入资源评估。研究表明鱼礁区大泷六线鱼平均体长、平均体重、渐近体长和渐进体重均大于对照区,自然死亡系数小于对照区,即鱼礁区大泷六线鱼个体较大、人工鱼礁对大泷六线鱼确有保护作用。本文首次将生物学参考点F0.1和Fmax及其不确定性分析应用于人工鱼礁区大泷六线鱼资源评估,结果表明3种不确定性水平下F0.1判断结果与无不确定性结果一致(F0.1Fcur),而Fmax随着不确定性水平的增加,可能反转无不确定性的结果(FmaxFcur),即存在误判的风险,故F0.1更适合礁区大泷六线鱼资源评估。结合Gulland理论、生物学参考点和单位补充量渔获量等判断,鱼礁区大泷六线鱼资源处于过度开发状态,应适当降低捕捞强度以保证其持续发展,对照区其资源处于合理开发状态,仍可通过提高捕捞强度来实现资源更为合理地利用。     

中间球海胆群体遗传学研究中AFLP引物数量及样本量的选择

采用10,20,30,40,50,60,70,80共8个样本量梯度,随机选择并逐步增加AFIP引物组合,研究了AFLP标记数量及样本量对中间球海胆(Strongylocentrotus intermedius)群体遗传学指标的影响。结果表明:基因多样性指数(H)、Shannon氏指数(I)和多态位点比例(PP)3个遗传学指标对样本量的敏感程度不同,PP指标受样本量影响较大,样本量≥50个时方稳定,H指标在样本量≥30时稳定下来,而I指标在样本量≥20时即不再出现显著差异。共采用6对A FIP引物对80只海胆进行群体遗传学研究。通过每1对、每2对、每3对、每4对、每5对引物组合分别计算各遗传学指标,发现前二者所得各值之间以及其与对照值(6对引物所得值)之间存在显著差异,而每三对引物组合计算的各指标间不存在显著差异。据此推测,对中间球海胆进行AFLP标记研究中,样本数量最好不少于50个;而若样本量足够大(80个个体),则至少需要3对AFLP引物(或不少于100个标记),方能对海胆群体进行准确的遗传学评价。     

应用巢式逆转录聚合酶链反应检测鱼类病毒性出血性败血症病毒(VHSV)

参照鱼类病毒性出血性败血症病毒序列,根据PCR引物设计的原则,设计巢式PCR引物,采用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,对如何快速检测鱼类病毒性出血性败血症病的方法进行了较为系统的研究,并对RT-PCR的反应条件进行了优化.结果表明,巢式RT-PCR扩增获得279bp的特异性片断,阴性对照无扩增条带.巢式RT-PCR扩增出的特异性片段经测序分析,结果证实与报道的序列完全一致.该方法最低可检测出0.1pg的鱼类病毒性出血性败血症病毒RNA.初步建立了VHSV的巢式RT-PCR检测方法,该方法灵敏、特异,可为VHSV的检测提供一个快速、有效的手段.     

Establishment of microsatellite-based triplex PCR for parentage analysis of Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis

Through exploring the microsatellite primers from the random genome sequences of Chinese shrimp (Fenneropenaeus chinensis), some microsatellite primers were obtained with rich polymorphic genetic information, and a triplex PCR was established using three primers (RS1101, RS0683 and H081 primers). By adjusting the final concentration of Mg2 , dNTP and primers, and using a touch-town PCR program, the optimum amplification parameters of PCR system were obtained, which could successfully amplify the three primers in a PCR reaction. In the denatured PAGE gel, the amplified DNA fragments of three primers RS1101, RS0683 and H081 could be easily identified each other. For the triplex PCR system, the PPE (probabilities of paternity exclusion) is 0.967 9, and the DP (discrimination power) is 0.999 327. Using the triplex PCR to test ten individuals of a parentage and their parents, an individual was excluded from the parentage in all of the three microsatellite loci, which might be mixed into the parentage for some unknown reason such as factitious misplay. The triplex PCR will be of great practical value in identifying the parentages of F. chinensis.     

中国北方沿海6个栉孔扇贝群体的AFLP分析

利用4对AFLP引物首次对我国北方沿海主要的6个栉孔扇贝养殖区的自然采苗群体进行了遗传多样性分析,共扩增得到191条清晰带谱,其中175条具有多态性。对各群体进行遗传多样性分析,结果表明各群体均具有较高的遗传多样性水平,香农式多样性指数在0.347 4～0.391 7之间。AMOVA结果表明遗传变异主要来源于群体内,占总遗传变异的87.22%。个体聚类结果表明,烟台、长岛、大连3个群体的个体聚在一起,可看做1个群体;而荣成群体的个体单独聚在一起,具有独立的遗传结构;胶南和日照的一部分个体聚在一起,其他大部分各群体单独聚在一起;推测是海洋环境和人工养殖影响的共同结果。     

三种蛏的遗传多样性分析

应用AFLP技术对浙南地区分布的小荚蛏(Siliqua minimai)、缢蛏(Sinonovacula constricta)和大竹蛏(Solen grandis)3种蛏进行了基因组DNA多态性检测,并对其遗传多样性进行了分析.利用筛选出的5对引物组合,共扩增出781个清晰的位点;小荚蛏、缢蛏和大竹蛏多态位点比例依次为79.22%、84.25%和64.82%,Nei's基因多样性指数分别为0.2971、0.3070和0.2785,Shannon's多样性指数分别为0.4402、0.4575和0.4010,种内平均遗传距离为0.2585、0.2691和0.1838.研究结果表明,这3种蛏的核DNA遗传多样性水平以缢蛏为最丰富,小荚蛏次之,大竹蛏最低;并且3种蛏的共享位点很少,遗传趋异比较明显,说明3种蛏的遗传关系比较远.     

AFLP技术在笛鲷的仔鱼鉴定及其分类学上的研究

以南沙群岛采获的勒氏笛鲷(Lutjanus russelli)、黄笛鲷(Lutjanus lutjanus)、红笛鲷(Lut janus sanguineus)、紫红笛鲷(Lutjanus argentimaculatus)、金焰笛鲷(Lutjanus fulviflamma)、线纹笛鲷(Lutjanus lineolatus)、画眉笛鲷(Lutjanus vitta)、马拉巴笛鲷(Lutjanus malabarius)、驼背笛鲷(Lutjanus gibbus)、约氏笛鲷(Lutjanus johni)、金带笛鲷(Lutjanus vaigiensis)11种笛鲷属的后期仔鱼为材料, 进行了基因组DNA的AFLP(扩增片段长度多态性)研究,通过笛鲷仔鱼和成鱼的AFLP电泳图谱的比较分析,将这11种笛鲷属的仔鱼成功分开.研究表明,最适合的AFLP引物组合是E+AGC/M+CAA,由这11种笛鲷共扩增出132 AFLP位点,每种笛鲷的AFLP条带数为43~69,在这11种笛鲷中,共享的AFLP条带数仅为7,同一种笛鲷仔鱼和成鱼AFLP遗传相似度在90%以上.根据这11种笛鲷的Nei遗传距离对Neighboring系统进行进化分析,并且与传统的笛鲷形态分类进行了比较.分子生物学可以阐释笛鲷属鱼类的系统进化和遗传亲缘关系,对传统形态分类学加以完善和补充.     

中国鲎(Tachypleus tridentatus)微卫星标记筛选及种群遗传多样性和遗传结构分析

采用FIASCO方法构建了中国鲎(Tachypleus tridentatus)(CA)_n微卫星富集文库,对214个阳性克隆进行测序,筛选获得60条含有微卫星的序列,其中可设计引物的序列共38条。38对微卫星引物在37个中国鲎个体中PCR检测发现,只有9个位点具有多态性,其等位基因数为5—14个,每个位点平均具有8.1个等位基因。9个位点之间不存在连锁。利用该9个具有多态性微卫星标记分析了中国沿海9个中国鲎地理群体的种群遗传多样性和遗传结构。结果表明:中国沿海的中国鲎种群遗传多态性水平仍较高, 9个地方群体间无遗传差异,它们之间未见显著分化,且有着较高的基因流;推测人为的迁移是造成遗传无分化的主要原因。我们建议中国鲎已绝迹的海域可从其他海域引入中国鲎个体来恢复地方群体资源。     

基于AFLP技术的海南三亚野生和养殖牡蛎遗传多样性研究

2008年夏季,从海南三亚分别采集26份养殖牡蛎和32份野生牡蛎样品(1份样品代表1个体),开展扩增片断长度多态性(AFLP)和数量性状分析,采用POPGENE 32软件计算多态性位点百分率、遗传多样性指数、Hardy-Weinberg遗传偏离指数、群体遗传相似度和遗传距离。基于AFLP分析获得的遗传距离和线粒体细胞色素氧化酶I亚基(CO I)基因序列,采用邻接法构建养殖和野生牡蛎的系统发育树。结果表明,选择性引物对牡蛎品种具有较好的鉴别效率;相比养殖牡蛎,野生牡蛎多样性丰富、品种间同源性较低、亲缘关系相差较远、遗传基础较宽;通过CO I基因序列分析可知,养殖牡蛎均为香港巨牡蛎Crassostrea hongkongensis,而野生牡蛎属于囊牡蛎属Saccostrea,主要为僧帽牡蛎Saccostrea cucullata。目前海南三亚牡蛎种质资源多样性相对丰富,引种还未对三亚自然环境的牡蛎资源造成明显影响。