Hfq对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)毒力的调控分析

为探讨分子伴侣Hfq对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)毒力的调控作用,本文分析了溶藻弧菌ZJ-T野生株、hfq突变株及回补株各项与毒力相关的生理生化指标。研究结果显示:在半固体和固体LBS平板中,缺失株游动和涌动能力显著降低(P0.001);hfq缺失株生物膜合成速度及合成量降低,但解离速度增加;在限铁环境下,缺失株生长有所减弱;缺失株胞外蛋白酶分泌增强(P0.01);同野生株和突变株相比,缺失株对小鼠成肌细胞系C2C12细胞几乎不致死,且其对石斑鱼的半数致死量提高3个数量级。实验结果表明:Hfq对溶藻弧菌毒力具有重要调控作用,并通过调控其运动、生物膜形成、铁代谢、胞外蛋白酶分泌等生理生化过程从而调控其毒力。本研究可为溶藻弧菌病害暴发的防治提供重要理论依据。     

病原性溶藻弧菌对大黄鱼鳃黏液黏附作用研究

采用3H-TdR同位素示踪方法研究了溶藻弧菌对大黄鱼鳃黏液黏附作用.结果表明,溶藻弧菌的黏附量随着菌浓度的增加而升高并在180 min后达到饱和;在温度15~30℃、pH偏酸条件下黏附作用较强,Na+是溶藻弧菌黏附作用必需的,Ca2+起着辅助作用;溶藻弧菌经营养饥饿、热处理及高碘酸处理后黏附作用有明显下降;8种碳水化合物都有不同程度的促进溶藻弧菌的黏附作用,其中葡萄糖、甘露糖、果糖及麦芽糖有明显促进作用.研究结果表明:海水中的溶藻弧菌可很好地黏附于大黄鱼鳃黏液,其黏附作用受环境因子影响,并且与溶藻弧菌的表面碳水化合物、热敏结构等有着密切关系.     

溶藻弧菌对大黄鱼表皮黏液的黏附特性研究

采用3H-TdR同位素示踪方法研究了溶藻弧菌对大黄鱼表皮黏液的黏附机制.试验结果表明溶藻弧菌经营养饥饿、热处理、抗体处理、蛋白酶及高碘酸处理后黏附作用明显下降;在8种碳水化合物的干扰下溶藻弧菌的黏附作用会有一定程度的变化,其中葡萄糖、果糖、甘露糖能明显促进溶藻弧菌的黏附作用;溶藻弧菌对大黄鱼表皮黏液中较大分子量的物质有较强的亲和力.这些结果表明溶藻弧菌对大黄鱼表皮黏液存在特异性黏附作用,这种黏附与细菌活力、其表面的蛋白类、糖类等物质以及黏液的化学组成都有密切关系.     

海洋假交替单胞菌端生和侧生鞭毛对生物膜形成的影响

海洋假交替单胞菌广泛分布于各种海洋环境中,能分泌多种生物活性物质和胞外酶类,多具有较强的生物膜形成能力。这些生物膜具有诱导矿化和吸引腐蚀生物幼体附着的功能,在海洋生态系统的能量和元素循环中扮演特殊角色。细菌的鞭毛系统介导细菌的运动行为,在营养的获取以及生物膜和浮游状态转化过程中发挥作用。有研究表明,鞭毛也是生物膜基质的有机组分,但目前海洋假交替单胞菌鞭毛系统在生物膜形成中的作用尚不清楚。本文以南海表层来源的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.SCSIO 11900)和深海沉积物来源的近源假交替单胞菌(Pseudoalteromonas.sp.SM9913)为研究对象,分别选取了编码鞭毛不同组分的基因进行敲除,研究鞭毛缺失对细胞游动性和生物膜形成能力的影响。结果表明,无论来自表层还是深海的假交替单胞菌都使用端生鞭毛维持细胞游动性,而且其缺失促进生物膜的形成。此外,深海来源的SM9913还具有侧生鞭毛。尽管这种鞭毛有助于提高细胞游动性,却不影响细菌的生物膜形成能力。这些端生鞭毛系统在近缘海洋假交替单胞菌中广泛分布,可能为该属菌株在不同海洋环境中获取营养、定殖及适应环境的...     

环境因子对鳗弧菌生长和胞外蛋白酶表达的影响

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是一种水产动物的重要致病菌,鳗弧菌分泌的胞外蛋白酶是该菌的致病因子之一.研究了环境因子对鳗弧菌W-1生长及胞外蛋白酶表达的影响.结果表明,鳗弧菌的最适生长温度为28℃,菌体生长量在21 h达到最高,胞外蛋白酶的活力在24 h最高.在37℃培养时,菌体生长和酶活力显著降低;添加葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等碳源物质均能显著促进菌体的生长,但对于胞外蛋白酶表达有明显抑制作用;1 mmol/L EGTA对茵体的生长和胞外蛋白酶表达没有明显影响,而1 mmol/L的EDTA强烈抑制鳗弧菌的生长及其胞外蛋白酶的表达.添加不同浓度的氨苄青霉素对菌体的生长及其胞外蛋白酶表达有明显的抑制作用.     

环境因子对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)粘附大黄鱼(Pseudosciaena crocea)表皮粘液影响的研究

采用3H-TdR同位素示踪方法研究了环境因子对溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液粘附作用的影响。试验结果表明,溶藻弧菌能很好地粘附于大黄鱼表皮粘液,其粘附量在菌浓度不超过6.52×108cfu/ml情况下随菌浓度的升高而升高;粘附量在25℃下孵育180min趋于饱和,在180min以内与孵育时间呈正相关关系;粘附作用在温度25—30℃、pH值偏酸、盐度35条件下较强;在无Na (盐度为0)时,无粘附作用;Ca2 能显著加强溶藻弧菌的粘附作用,而Mg2 作用不明显。这些结果表明,溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液有较强的粘附作用,其粘附作用受温度、盐度、pH值等环境因子的影响。     

拮抗菌对病原性溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)粘附大黄鱼(Pseudosciaena crocea)表皮粘液的影响

采用3H-TdR同位素示踪法研究了病原性溶藻弧菌和9株拮抗菌对大黄鱼表皮粘液的粘附动力学。结果表明,10株细菌的粘附作用都符合饱和粘附动力学特征;R4、R13和R32等3株拮抗菌的最大粘附量高于溶藻弧菌;9株拮抗菌的分离常数都高于溶藻弧菌;R32的亲和指数大于溶藻弧菌,其余8株拮抗菌的亲和指数都小于溶藻弧菌。测定了9株拮抗菌对病原性溶藻弧菌粘附大黄鱼表皮粘液的竞争、排斥和置换作用,结果显示:9株拮抗菌在竞争条件下都能极显著减少溶藻弧菌对表皮粘液粘附(P<0.01);在粘附排斥方面,R4、R13、J26、J28、J312、Y59等6株拮抗菌能显著排斥病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附作用(P<0.05);在粘附置换方面,J26、J28等2株拮抗菌能极显著(P<0.01)降低病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附量。研究结果表明,病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液有较强的粘附作用;9株拮抗菌能够抑制溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附作用,其中竞争作用效果最好,排斥作用次之,置换作用的效果最差;拮抗菌对病原菌粘附的抑制效果受多种因素的影响,各菌株的粘附动力学参数有重要的影响作用。     

四种弧菌对中国对虾的致病性研究

１９９５年８月－１９９６年４月,采用注射感染、浸浴感染、创伤感染和投喂感染比较溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、弗尼斯弧菌及其胞外产物对中国对虾的致病性,测定它们的半致死浓度,观察弧菌感染引起的病理组织变化。结果表明,注射感染中,溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌和弗尼斯弧菌２４小时的半致死浓度（ＬＤ５０）分别是１．２×１０＾６,６．５×１０＾７,４．０×１０＾８,６．８×１０＾９（ＣＦＵ／ｍｌ）;４８小时     

斑节对虾病原菌胞外产物的致病性研究

由养殖濒死病虾体内分离的副溶血弧菌(2019#)、溶藻弧菌(4302#)和嗜水气单胞菌(1003#)培养液中分别提取了胞外产物,测定了酶成分,定量分析了蛋白酶及磷酸酯酶的活性.用细菌胞外产物粗提液对斑节对虾进行致死试验,戊二醛固定致死对虾的肝组织,电镜观察了斑节对虾肝组织的超微病变,初步探讨了三株细菌胞外产物诱发虾病的病理.     

致病溶藻弧菌脂多糖对点带石斑鱼毒性和免疫原性的影响

以热酚水抽提法提取致病溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)粗脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS),并将不同浓度的溶藻弧菌粗LPS通过腹腔注射法接种点带石斑鱼(Epinephelus coioides),研究该LPS对点带石斑鱼毒性和免疫原性的影响,并同弱致病溶藻弧菌粗LPS及高纯度大肠杆菌(Escherichia coli)LPS对石斑鱼的刺激效果进行比较。结果表明:溶藻弧菌致病株和弱致病株粗LPS均对石斑鱼具有比较强的毒性,溶藻弧菌LPS对石斑鱼的免疫原性随LPS浓度的增高而增强,高纯度大肠杆菌LPS对石斑鱼的免疫原性效果要优于溶藻弧菌粗LPS。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)CTL基因SNP位点E4-205 C/T与抗溶藻弧菌相关性分析

C-型凝集素(C-typelectin,CTL)是甲壳类动物体液免疫中重要的免疫因子之一。但CTL基因在溶藻弧菌对三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)感染的过程中的表达及抗病机制尚有待进一步研究。为初步阐明CTL基因SNP E4-205 C/T位点与抗溶藻弧菌感染相关的分子机制,对不同基因型梭子蟹进行溶藻弧菌感染,通过绝对定量方法分析不同基因型梭子蟹肝胰腺、肌肉组织中溶藻弧菌的复制情况。发现溶藻弧菌感染后12 h内梭子蟹肝胰腺、肌肉组织中C/C组细菌数量显著高于T/T组,结果表明T/T组梭子蟹抗感染能力显著高于C/C组。进一步对该位点非同义突变(ACT-ATT)导致的一个氨基酸改变(Thr-Ile)的两种蛋白进行体外重组表达,并对两种重组蛋白CTL-ATT及CTL-ACT进行活性分析。发现两种重组蛋白对溶藻弧菌生长均具有一定的抑制作用, CTL-ATT的抑菌活性显著高于CTL-ACT。重组蛋白CTL-ATT与PAMPs的结合活性高于CTL-ACT与PAMPs的结合活性,同时两种蛋白与PAMPs和溶藻弧菌的结合活性具有浓度依赖性。结果表明三疣梭子蟹CTL基因参与机...     

感染溶藻弧菌及白斑综合症病毒后凡纳滨对虾不同组织的Toll样受体基因表达变化研究

为研究不同类型Toll样受体基因在凡纳滨对虾免疫调控机制中的作用,实验首先通过荧光定量PCR方法检测了凡纳滨对虾3种Toll样受体基因在不同组织中的表达情况。结果表明凡纳滨对虾3种Toll样受体基因m RNA在各组织中均有表达。其中,Toll1基因在肌肉,血淋巴,心脏和鳃均有较高表达,心脏表达量最高;Toll2基因在血淋巴,心脏和鳃均有较高表达,其中在鳃表达量最高;Toll3基因在鳃和心脏有较高表达,其中在鳃表达量最高。实验还对人工感染溶藻弧菌及白斑综合症病毒后凡纳滨对虾3种Toll样受体基因在不同免疫组织的表达变化差异进行研究。感染白斑综合症病毒后凡纳滨对虾血淋巴及鳃中3种Toll样受体基因表达量均显著提高,并在各自达到表达峰值后逐渐下降直至恢复到感染前水平。感染溶藻弧菌后凡纳滨对虾血淋巴中3种Toll样受体基因表达量均显著提高;鳃中Toll1及Toll3表达量分别于感染后3h和12h有显著提高,而Toll2表达量无显著提高。由此推测3种Toll样受体基因均可能参与白斑综合症病毒感染所引起的免疫调控;而在溶藻弧菌感染所引起的免疫调控中,除了Toll1,Toll3参与鳃的免疫调控外,Toll2基因还参与血淋巴中的先天性免疫调控。长期感染白斑综合症病毒或溶藻弧菌后,凡纳滨对虾3种Toll样受体基因在血淋巴与鳃中的表达量均显著升高,这可能与虾体在长期感染过程中,需要不断保持较高免疫水平有关。     

溶藻弧菌体外刺激泥蚶(Tegillarca granosa)血细胞后早期转录组研究

泥蚶(Tegillarca granosa)是我国传统养殖贝类,细菌性疾病导致的死亡已成为制约泥蚶养殖业发展的重要因素,血细胞是泥蚶免疫防御的执行者,血细胞能直接吞噬异物,能通过包囊作用将异物包裹,血细胞还在炎症反应和伤口修复中发挥作用。采用RNA-seq测序技术研究了溶藻弧菌体外刺激后泥蚶血细胞3h和6h时转录组动态变化,与未受刺激血细胞相比,3h时1790个基因表达发生显著改变,包括1319个上调基因和471个下调基因;6h时3183个基因表达发生显著改变,包括2629个上调基因和554个下调基因。KEGG通路富集分析发现溶藻弧菌刺激后免疫相关多个信号通路或生物学过程发生显著改变,如吞噬体、细胞凋亡、蛋白酶体、内质网加工、局部黏附等。部分免疫相关基因表达丰度3h时变化不显著而6h时发生显著改变,部分免疫相关基因3h和6h时表达丰度均显著改变。研究结果为泥蚶血细胞早期免疫反应提供了新的见解,为泥蚶抗病机理研究提供了理论基础。     

海带褐藻多酚对绿烂海带表面分离的一株细菌的抑菌效果研究

海带苗绿烂病暴发严重威胁海带养殖生产,给海带养殖业造成巨大经济损失.研究发现,海带中的多酚化合物可以抵御海带病害初期病原体侵入.为研究多酚对绿烂海带表面附生菌的抑菌效果,在病烂部位分离出一株细菌,通过16s rRNA基因测序的方法,证实该细菌为小孔芽孢杆菌(Bacillus foraminis).进一步以健康海带为原料...     

马氏珠母贝(Pinctada fucata)血细胞RNA-Seq转录组数据中补体样组分分析

补体系统在体液免疫中发挥着重要作用,是连接先天免疫和适应性免疫的枢纽。本研究基于前期转录组RNA-Seq数据检索马氏珠母贝(Pinctada fucata)补体样组分,并对其结构域及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)刺激后的基因表达水平进行了分析。结果表明,共获得68条补体样成分unigene,分别编码14个含C1q结构域蛋白、14个凝集素蛋白、4个纤维蛋白原相关蛋白、12个丝氨酸蛋白酶、10个含硫酯键蛋白、1个末端补体分子C6、5个补体受体、1个补体因子及7个纤胶凝蛋白;结构域分析表明,马氏珠母贝补体样组分均含有相应的保守结构域,与其他贝类补体组分的研究结果基本一致;表达量分析表明,经溶藻弧菌刺激后, 68条补体样组分unigene中共有21条unigene表达上调,其中12条为模式识别受体unigene。结合牡蛎等贝类补体组分的研究结果,推测贝类已形成一个含有多种补体组分的原始补体系统,且可能以凝集素途径或替代途径行使补体的生物学功能。以上研究结果为深入了解马氏珠母贝及其他海洋无脊椎动物免疫防御机制、探讨补体系统的进化起源提供了新的依据。     

大黄鱼(Larimichthys crocea)白细胞介素10(IL-10)基因克隆及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染后表达变化分析

白细胞介素10(interleukin10,IL-10)是鱼类先天性免疫因子之一,在炎症反应和免疫调节中有着重要作用。本研究获得大黄鱼(Larimichthys crocea)IL-10基因cDNA序列,由899个核苷酸组成,含1个555bp的开放阅读框、编码184个氨基酸,预测编码蛋白分子量为21.24kDa、N端有22个氨基酸组成的信号肽序列。氨基酸序列多重比对表明大黄鱼IL-10具有IL-10家族特征性序列和构成2对二硫键的4个保守性半胱氨酸,与欧洲鲈(Dicentrarchuslabrax)IL-10序列相似性最高(78.5%);系统进化树分析显示大黄鱼IL-10和其他鱼类IL-10形成一个大簇,与欧洲鲈进化关系最近。荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测结果显示健康大黄鱼IL-10基因在鳃和肠中高表达,肝和头肾中低表达;溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染后大黄鱼肠、脑、脾、肝和头肾中IL-10基因表达量均显著上调(P0.05),其中头肾和肝中上调幅度最大(分别为菌侵染前的10.06倍和8.79倍)。综上,大黄鱼IL-10基因表达与病原菌感染密切相关,为深入研究大黄鱼IL-10的生物学功能及免疫机制提供了基础资料。     

北极细菌Pseudoalteromonas sp.A2对H2O2胁迫的转录组分析

海水中的高溶解氧浓度、低温和UV辐射导致了氧胁迫是北极海洋细菌面临的主要胁迫因素之一。本文对北极细菌Pseudoalteromonas sp.A2对H₂O₂导致的氧胁迫的应答特征进行了转录组测序和基因差异表达的比较分析,以期发现与氧胁迫相关的关键功能基因。研究表明,与对照组相比,1 mmol/L的H₂O₂可导致菌株A2转录组的很大变化,包括109个基因的显著上调与174个基因的显著下调。COG分析表明,在功能已知的基因中,与转录后修饰、蛋白质转换和分子伴侣相关的基因大部分显著上调,而与氨基酸运输和代谢等相关基因则大部分显著下调。值得指出的是,有18个与鞭毛相关的基因和4个与热激蛋白相关的基因显著上调;同时,有9个与细胞色素和细胞色素氧化酶相关的基因和5个与TonB依赖受体相关的基因显著下调。在GO分析表明具有抗氧化活性的18个基因中,只有1个基因的表达显著上调,而有2个显著下调。简言之,RNA-Seq表明,除了传统的抗氧化基因和应激蛋白外,鞭毛相关基因和功能未知基因在菌株Pseudoalteromonas sp.A2的氧胁迫适应性中起着重要作用。该转录组分析和氧胁迫相关基因的发现有助于了解北极细菌的氧胁迫适应机制。     

基于核酸适配体的差减荧光法检测鳗弧菌(Vibrio anguillarum)

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)可感染鳗鲡、虹鳟和大菱鲆等多种水产动物,是水产养殖中的一种重要病原菌,对其进行快速检测是病害防控的前提和基础。利用鳗弧菌与其核酸适配体之间有较强的亲和特异性,首次建立了一种基于核酸适配体的可定量检测鳗弧菌的差减荧光法。该方法对鳗弧菌有较好的特异性,对鳗弧菌的检测荧光值是其他菌(溶藻弧菌、哈维氏弧菌、铜绿假单胞菌、变形假单胞菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌和大肠杆菌)的4～11倍,对鳗弧菌的最低检测限为10²CFU/mL,可用于10²～10⁸CFU/mL的范围内的定量检测。通过对不同盐度海水和鱼体组织样品进行加标回收检测,结果表明,回收率和相对标准偏差等指标均符合相应的标准,说明该检测方法可用于海水样品和水产动物组织中鳗弧菌的检测。