Heterologous expression of acyl-ACP desaturase （FAB2） from Chlamydomonas reinhardi in Escherichia coli and its expres- sion features in response to different temperature and salinity stresses

脂肪酸去饱和酶（fattyaciddesaturase）是不饱和脂肪酸合成途径的关键酶,催化脂肪酸链的特定位置脱氢形成双键,其通过引入双键调节脂肪酸不饱和度,以适应周围环境的变化。菜茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）质体酰基一酰基载体蛋白去饱和酶（plastidacyl—ACPdesaturase,FAB2）在△9位脱氢,催化脂肪酸中第1个双键的形成。本文首先在大肠杆菌中异源表达了FAB2,另外将其氨基酸序列与其他高等植物、微藻、真菌等进行了多序列比对以及系统进化分析,推测其与高等植物亲缘关系更近。利用定量RT-PCR技术研究了衣藻FAB2基因不同胁迫条件下的表达模式,结果表明4℃＋0％NaCl,25℃＋1％NaCl胁迫条件下FAB2基因表达量都有一定程度升高。     

三角褐指藻Δ5去饱和酶基因的原核表达

Δ5脂肪酸去饱和酶(Δ5fatty acid desaturase)是合成花生四烯酸(AA)和EPA的关键酶。为了构建三角褐指藻Δ5脂肪酸去饱和酶基因(简称D5)的原核表达重组质粒,并实现在E.coli BL21(DE3)中的表达。本研究根据GenBank中三角褐指藻Δ5脂肪酸去饱和酶基因序列,设计引物,扩增该基因并插入到pET28a中,测序鉴定后,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达产物。结果表明pET28a-D5构建成功,IPTG能诱导D5特异性表达。     

绿潮浒苔具有广泛底物特异性的二酰基甘油酰基转移酶1的功能研究

三酰基甘油(甘油三酯)是生物体内主要的碳和能量储存形式，也是细胞膜和信号分子的重要组成部分，它们在多种生理过程和环境胁迫响应中发挥重要作用。酰基辅酶A:二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)催化真核生物甘油三酯合成途径中最后一步和唯一的酰基化步骤。本研究从绿潮浒苔中鉴定并获得了一个新的二酰基甘油酰基转移酶UpDGAT1基因，并在酿酒酵母甘油三酯缺失合成四重突变体中通过异源表达验证了该基因的功能。薄层色谱和BODIPY染色结果表明，浒苔UpDGAT1基因能够恢复酵母中甘油三酯的合成和脂质体的形成。酵母细胞的脂肪酸组成分析显示，浒苔UpDGAT1具有广泛的底物特异性，可接受饱和、单不饱和和多不饱和酰基辅酶A作为底物。高盐度和高温胁迫增加了浒苔UpDGAT1基因的表达和浒苔甘油三酯的积累。本研究为进一步解析UpDGAT1在浒苔甘油三酯积累和胁迫响应中的作用提供了基础。     

小球藻△12脂肪酸去饱和酶基因的克隆与序列分析

利用已报道的△12脂肪酸去饱和酶基因序列的保守区域,设计简并引物,通过RT-PCR的方法获得了小球藻NJ-7的内质网型△12脂肪酸去饱和酶基因(CvFAD2)的部分序列,然后采用RACE的方法分别克隆到5'片段和3'片段,拼接后设计特异引物扩增到全长cDNA.该基因全长为2 032 bp,ORF为1158 bp,编码385个氨基酸,分子质量约为44 ku.根据已经得到的CvFAD2序列推导成氨基酸序列与一些已知物种的FAD2氨基酸序列相比较,同源性分别为普通小球藻(Chlorella vulgaris)75%,莱菌衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)57%,石榴(Punica granatum)57%,麻疯树(Jatropha curcas)52%.系统发育分析表明,南极小球藻CvFAD2基因与真核微藻(衣藻和普通小球藻)的FAD2基因聚在一起,介于真菌与高等植物之间,并且真核微藻FAD2基因与高等植物的同源性更高,推测其在进化上与高等植物的亲源关系更近.     

Fe3+胁迫对假微型海链藻中性脂累积及DGAT 表达的影响

二酰甘油酰基转移酶(DGAT)是脂类合成途径中的关键酶,其表达水平的高低影响着脂类含量的高低。微量元素Fe3+对于微藻的生长不可或缺,且影响着微藻中油脂的累积。本实验以假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)为研究对象,分析了铁限制(0.000 03mmol/L)和高铁胁迫(0.3 mmol/L)2种Fe3+胁迫条件下,不同种群生长期中性脂累积及二酰甘油酰基转移酶(DGAT)的基因表达受到的影响。结果显示:铁限制条件下,微藻种群生长及其中性脂的合成受到抑制,DGAT的表达量下降;高铁胁迫条件下,高浓度Fe3+可促进中性脂合成与DGAT的表达,但抑制微藻种群生长。因此,富铁条件下更利于总脂的收集。     

低温和摄食对虹鳟脂肪酸合成基因表达的影响

通过分析低温和摄食对虹鳟(Oncorhynchus mykiss)脂肪酸生物合成相关基因表达的影响,探究其低温适应机制,为虹鳟的成功越冬提供一定的理论依据。本实验设定了正常温度摄食组(NF)、正常温度不摄食组(NU)、低温摄食组(CF)和低温不摄食组(CU)4个实验处理,分别测定了虹鳟肝脏和肌肉在1、3、5、7和14d时硬脂酰辅酶A去饱和酶(Stearoyl-Coenzyme A desaturase,SCD)、Δ6-去饱和酶(Δ6fatty acid desaturase,Δ6Fad)和延长酶2(Elongation of very long chain fatty acids like 2,Elovel2)3个基因的相对表达水平。实验表明:摄食显著影响虹鳟肝脏对脂肪酸的生物合成,在营养供给充足的情况下,主要通过脱酰和重酰化作用(替代作用)来满足机体对单一不饱和脂肪酸(Monounsaturated fatty acid,MUFA)和多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid,PUFA)的需求;在营养供给不足时,可以通过相关脂肪酸生物合成通路合成MUFA和PUFA。虹鳟肌肉中有大量脂肪沉积,因而短时间的不摄食对其影响较小。当周围环境温度降低时,SCD、Δ6Fad和Elovel2三个基因的表达量均显著上升,表明虹鳟为了适应低温,生物膜磷脂脂肪酸中不饱和脂肪酸的比例上升,虹鳟肝脏和肌肉中MUFA和PUFA生物合成量增加。此外,虹鳟肝脏SCD mRNA的表达量在CF组较低,这可能是因为摄食可以在一定程度上补充MUFA。虹鳟在正常营养条件下,大约在5～7d可适应低温;在长时间的饥饿和低温胁迫下,虹鳟机体内的脂肪酸生物合成会受到影响。     

鳜鱼(Siniperca chuatsi)脂肪酸去饱和酶和延长酶基因全长cDNA序列的克隆与分析

利用RT-PCR和RACE方法克隆得到鳜鱼肝脏中控制高不饱和脂肪酸合成的脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase,FAD)和脂肪酸延长酶(fatty acid elongase,ELO)基因的全长cDNA序列。FAD基因的全长cDNA序列1882bp,编码445个氨基酸,该蛋白序列含有FAD全部的特征结构区,包括3个组氨酸簇、2个跨膜区和1个细胞色素b5结构域,与其它鱼类FAD氨基酸序列的同源性为66.5%-90.1%,系统树分析显示其与欧洲鲈鱼和金头鲷等海水鱼类的亲缘关系最近。获得的ELO基因全长cDNA序列1401bp,编码294个氨基酸,该蛋白序列含有单一的氧化还原中心组氨酸簇、内质网停留信号和多个跨膜区等ELO特征结构,与其它几种鱼类ELO氨基酸序列的同源性为71.8%-86.7%,系统进化分析显示其与南方蓝鳍金枪鱼和金头鲷的亲缘关系较近。鳜鱼FAD和ELO基因全长cDNA序列的获得可为进一步研究其HUFA合成能力及调控机理奠定基础。     

微拟球藻硫脂酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

微拟球藻(Nannochloropsis oceanica)基因组序列注释的硫脂酶基因(NoTE)长1 314bp,其编码的硫脂酶长437氨基酸,与其他物种硫脂酶序列相似性较低。为验证其功能,将NoTE克隆到原核表达载体pET-30a上并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测到预期大小的蛋白质条带。气相色谱(GC)分析显示,表达NoTE未改变大肠杆菌脂肪酸种类,但改变了其总脂肪酸含量和脂肪酸比例,其C14∶1、C16∶0、C16∶1、C18∶1及总脂肪酸含量较不含重组质粒菌株分别提高了11%、18%、32%、49%和30%。研究结果证明了克隆的硫脂酶基因能在大肠杆菌中表达并具有相应的酶活性。     

莱茵衣藻叶绿体型磷酸甘油醛脱氢酶过表达对其储能物质生产的影响

叶绿体型磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)光合固碳生产储能物质的关键酶,加深对该酶生物学功能的认识对探索微藻光合固碳有着重要意义。本文首先构建了2种叶绿体型GAPDH过表达转化株,实现了持续稳定和生长偶联2种不同模式的叶绿体型GAPDH的表达;通过对比分析2种转化株与野生株的生长(OD与干重)、叶绿素荧光参数F_v/F_m、碳水化合物含量以及脂肪酸种类与含量的变化规律,考察过表达GAPDH对莱茵衣藻储能物质生产能力的影响。研究表明,过表达叶绿体型GAPDH实现了转化株碳水化合物和脂肪酸产率的明显提升。与野生株相比,稳定过表达GAPDH的转化株不仅能够积累较高含量的碳水化合物,且脂肪酸最大产率提升了55%,最大储能物质产率提升了75%。本研究首次从实验角度证实,莱茵衣藻叶绿体型GAPDH的过表达可显著提升其储能物质生产能力,本研究对基于微藻光合固碳的合成生物学的发展起到推动作用。     

真蛸FAXDC2基因的克隆及其表达分析

FAXDC2(fatty acid hydroxylase domain-containing protein 2)是脂肪酸羟化酶家族中的成员,在脂肪酸的合成与代谢中发挥重要功能。真蛸(Octopus vulgaris)是中国南方近海的经济种类,为了研究饥饿对真蛸FAXDC2(OvFAXDC2)基因表达的影响,本研究从课题组真蛸转录组数据库中筛选获得OvFAXDC2基因序列。采用从头至趾方法进行验证,最终获得OvFAXDC2的cDNA全长序列共1384 bp。它包含100 bp的5′非编码区(UTR)、228 bp的3′UTR和1056 bp的开放阅读框(ORF), ORF共编码351个氨基酸,预测其分子量为3.98 kDa,理论等电点为8.93。系统进化树分析显示,真蛸和加州双斑蛸(O. bimaculoides)聚为一支,而与其他无脊椎动物分开。实时荧光定量PCR分析表明, OvFAXDC2在消化腺中表达量最高,在鳃和鳃心中次之。在幼体饥饿试验中,随着时间的推移, OvFAXDC2表达量先升后降,在第三天达到最高,表明OvFAXDC2表达量的变化趋势可作为幼体代谢是否正常的一个指标。     

大菱鲆周期蛋白依赖激酶基因cdk1、cdk6克隆及表达分析

通过同源克隆以及5′/3′RACE的方法扩增得到大菱鲆(Scophthalmus maximus)细胞周期蛋白依赖激酶基因cdk1和cdk6的全长c DNA序列,在m RNA水平上分析了它们组织表达特征,并对比分析了静水压处理对其胚胎期表达的影响。结果显示,cdk1基因全长c DNA序列为1281 bp(Gen Bank登录号:KP339306),编码区为912 bp;cdk6基因c DNA全长1400 bp(Gen Bank登录号:KT186374),编码区长度为978 bp。组织RT-PCR分析表明,cdk1基因表达具有广泛性,在性腺、肾脏等生长发育较快的组织中表达量较高;cdk6基因也在多个组织中表达,在性腺中表达量最高。通过Real time RT-PCR检测基因在胚胎中的表达水平发现,静水压处理组cdk1、cdk6在胚胎发育中,总体变化趋势与对照组类似。大菱鲆胚胎对照组中cdk1在原肠期以前相对神经胚期及以后时期表达量较高,静水压处理组基因表达变化与对照组趋势相同;对照组中cdk6在原肠期出现表达高峰,但静水压处理组在原肠期表达量相对较低。静水压处理对cdk1和cdk6的表达量的影响不同,这可能与基因还有除调控细胞周期的其他功能有关。为解析这两个基因在大菱鲆胚胎发育中的作用及其机制提供了参考。     

牙鲆耐寒相关基因CIRP、HMGB1的克隆及表达特征分析

为鲆鲽鱼耐低温标记辅助育种研究和应用提供候选基因,并了解耐寒相关基因在低温下的表达图示,作者通过同源克隆以及5?/3?RACE的方法扩增得到了牙鲆(Paralichthys olivaceus)CIRP和HMGB1基因。组织表达谱分析显示,这两个基因在脑、鳃、心脏、肌肉、肝脏、肠等组织均有表达,但HMGB1基因在鳃中表达较弱。低温胁迫后,两基因随着胁迫时间的延长其表达量在肌肉中都出现先上升后下降的趋势:在0~12 h逐渐上升并达到最大值,然后下降恢复至最初水平。但在肝脏和脑组织中的变化趋势却不同,低温胁迫后0~2 h HMGB1基因在脑中的表达量上升至最高,然后下降至最初水平,在肝脏中变化不大。而CIRP基因在低温胁迫后0~2 h在肝脏中表达量处于上升趋势,然后下降至初始水平,在脑中变化不大。由此推测,这两个基因在低温条件下都参与了机体对外界的抵抗,特别是在抵抗外界寒冷的主要组织—肌肉中发挥作用,可能共同参与了机体的免疫反应,对低温胁迫环境下的鱼体进行保护,可以作为鱼类耐低温标记筛选的候选基因。     

缢蛏生长因子受体结合蛋白2基因克隆、时空表达及SNP筛查

为了探索生长因子受体结合蛋白2（GRB2）在缢蛏生长发育中的作用，本实验基于缢蛏转录组文库，利用SMART RACE技术克隆缢蛏GRB2（Sc-GRB2）基因的cDNA全长序列，分析其在不同组织和发育时期的表达差异，并在外显子中进行了SNP位点筛选。结果表明，Sc-GRB2基因cDNA全长1 223 bp，开放阅读框711 bp，编码236个氨基酸；氨基酸序列比对发现，缢蛏与文蛤、泥蚶等双壳贝类同源性较高（64%、59%），而与其他物种的同源性为45%~58%，表明GRB2基因比较保守；不同组织的荧光定量PCR （qRT-PCR）结果显示，Sc-GRB2基因在缢蛏7个组织中均有表达，其中足中的表达量极显著地高于其他6个组织（P<0.01）；在8个发育时期的表达差异分析发现，该基因在稚贝期表达量极显著地高于其他7个时期（P<0.01）。SNP位点筛选结果表明，在Sc-GRB2基因的外显子区域共发现11个SNP位点。     

斑节对虾TSG101基因的克隆及表达分析

为探究肿瘤易感基因101(简称TSG101)对斑节对虾(Penaeusmonodon)的免疫应答作用,了解在细菌刺激下斑节对虾的机体发生的变化机制,本研究以哈维弧菌(Vibrioharveyi)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)为实验组,以磷酸缓冲液(PBS)为对照组,通过荧光定量分析展开对斑节对虾对菌刺激的免疫应答作用。结果显示,斑节对虾的TSG101在各组织中均有表达,在肝胰腺中的表达量最高。在金黄色葡萄球菌刺激下,斑节对虾的TSG101在肝胰腺中的表达量与对照组相比呈极显著上调(P0.01),第12小时的TSG101 mRNA的表达量达到最大(为对照组的21.60倍);在鳃中的表达量与对照组相比呈极显著上调(P0.01),第6小时斑节对虾TSG101的表达量达到最大值(为对照组的3.64倍)。在注射哈维弧菌第9小时,肝胰腺中的PmTSG101 mRNA表达量极显著上调(P0.01)且达到最大(为对照组的2.50倍)。实验结果初步表明,斑节TSG101参与斑节对虾的先天免疫反应,在金黄色葡萄球菌和哈维弧菌的刺激的情况下,该基因RNA水平的表达情况发生明显变化。     

企鹅珍珠贝Creb2基因的克隆及表达分析

CREB(cAMP response element binding protein)是一种真核生物中广泛存在的调控因子。为了探讨企鹅珍珠贝(Pteria penguin)Creb基因的序列和表达特征,为进一步阐述Creb的生理功能提供科学依据,本研究利用RACE-PCR技术克隆到企鹅珍珠贝一个Creb基因的全长序列,分析其理化性质和进化地位;利用荧光定量PCR分析Creb基因在各组织中的表达特征。结果表明,该企鹅珍珠贝Creb基因的c DNA全长为1484 bp,其中开放阅读框(ORF)为1071 bp,编码356个氨基酸,5′非编码区为218 bp,3′非编码区为195 bp,C端包含一个碱性亮氨酸拉链结构(basic region leucin zipper,b ZIP)。预测其分子质量为39.49 k D,等电点为4.43。序列比对显示该企鹅珍珠贝Creb基因与欧洲平牡蛎(Ostrea edulis)和太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)的Creb2同源性(identity)最高,分别为46.3%和46.1%,故命名为pp Creb2;系统进化树分析结果与传统形态学分类结果相吻合。荧光定量PCR分析显示,pp Creb2在企鹅珍珠贝的各个组织中组成性表达,其中在足中表达量最高,鳃中其次。     

企鹅珍珠贝Dmrt2基因的克隆及表达分析

本研究利用RACE-PCR技术获得企鹅珍珠贝(Pteria penguin)一个Dmrt2基因cDNA的全长序列,通过荧光定量PCR分析Dmrt2基因在各组织中的表达特征,以及在早期卵巢、成熟期卵巢、早期精巢、成熟期精巢和排放期精巢中的表达变化。结果表明,Dmrt2基因全长1 257bp,其中开放阅读框(open reading frame,ORF)为951 bp,编码316个氨基酸,5′非编码区(untranslated region,UTR)为52 bp,3′UTR为254 bp,第20位到第73位氨基酸为DM结构域。预测其分子质量为36.61ku,等电点为9.80。氨基酸序列比对显示该企鹅珍珠贝Dmrt2基因与黑蝶真珠蛤(Pinctada margaritifera)和马氏珠母贝(Pinctada martensii)的Dmrt2基因同源性(identity)最高,分别为46.0%和45.7%。其中在DM结构域高度同源。荧光定量PCR分析组织表达特征显示,Dmrt2在企鹅珍珠贝的外套膜、鳃、消化盲囊、足、精巢和卵巢均有表达,其中在精巢中表达量最高(P0.05),足为其次,在闭壳肌中没有检测到Dmrt2表达。对性腺发育不同时期的表达量分析发现,Dmrt2在发育早期和成熟期卵巢中表达量都很低,在发育早期精巢中表达量较高,在成熟期精巢检测到最大表达量(P0.05),到精巢排放期表达显著下降,推测Dmrt2可能与企鹅珍珠贝精巢的发育有关,可能参与了企鹅珍珠贝雄性性别分化和性腺发育这一生理过程。     

缢蛏（Sinonovacula constricta）GST和HSP90基因克隆及其在氨氮胁迫下的表达特征分析

克隆获得缢蛏(Sinonovacula constricta)谷胱甘肽S-转移酶(Sc-GSTσ)和热休克蛋白90(Sc-HSP90)基因的cDNA全长，分析了它们的组织表达差异及其在氨氮胁迫下的表达特征。结果表明，Sc-GSTσ的全长cDNA为1 414 bp，含有639 bp的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，编码212个氨基酸，Sc-GSTσ氨基酸序列与其他物种的GST氨基酸序列同源性为31.88%～43.40%；而Sc-HSP90的全长cDNA为2 752 bp，ORF为2 181 bp，编码726个氨基酸，其氨基酸序列与其他物种HSP90的氨基酸序列同源性为76.77%～87.05%。荧光定量PCR分析发现，Sc-GSTσ和Sc-HSP90在缢蛏各组织中均有表达，两者均在肝胰腺中表达量最高。氨氮胁迫后，Sc-GSTσ和Sc-HSP90 mRNA在肝胰腺中表达均显著上调(p<0.05)，表明氨氮胁迫引起机体的应激反应，2个基因可能参与机体解毒或防御过程。但胁迫后期表达量下降推测是机体的防御能力有限，不足以完全保护宿主免受应激诱导的细胞损伤。     

中国明对虾血蓝蛋白C末端片段在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性

为研究中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)血蓝蛋白C末端(FcHC-C)的抗菌功能,将血蓝蛋白基因FcHC的2个C末端基因片段连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建酵母表达载体pPIC9K/FcHC-C。该载体经SalI酶切后,采用PEG法转化毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)。转化子经过PCR鉴定后,阳性克隆通过含有G418的YPD平板筛选,获得高拷贝重组子。重组毕赤酵母利用甲醇诱导表达目的基因。经Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析结果表明,利用酵母工程菌成功表达了血蓝蛋白C末端片段(rFcHC-C1和rFcHC-C2)。抑菌活性鉴定实验结果显示,重组蛋白rFcHC-C1和rFcHC-C2作为阴离子抗菌肽具有抗真菌和抗细菌的活性。     

海蜇dmrta2基因的克隆及其在横裂生殖中的表达分析

Dmrt基因家族在后生动物性别决定与分化以及组织和器官的形成等发育过程中发挥着重要作用。为探究dmrt家族基因在海蜇(Rhopilema esculentum)横裂生殖中的功能,本研究以海蜇转录组测序获得的dmrta2基因片段为基础,通过RACE技术获得了海蜇dmrta2基因的cDNA全长,并分析了其在横裂生殖不同时期的表达模式。结果显示海蜇dmrta2基因cDNA全长为1 804 bp,开放阅读框为1 011 bp,所编码蛋白质含336个氨基酸,分子质量为37.25 kDa,理论等电点为9.11。预测海蜇dmrta2编码蛋白为亲水性蛋白质,无跨膜区域,不含信号肽。在33至79位氨基酸之间具有dmrt基因家族保守的DM结构域,与珊瑚、果蝇等物种的同源基因相应区域高度一致。系统进化分析显示,海蜇DMRTA2与鹿角珊瑚DMRTA2和DMRT3以及海葵DMRTA2的亲缘关系最近。原位杂交显示dmrta2基因在海蜇横裂生殖后期主要表达于感觉缘叶原基位置,在初生碟状体中表达于感觉棍位置。研究结果表明,dmrta2基因参与海蜇横裂生殖过程,可能主要与感觉棍神经系统的分化发育相关,研究为进一步解析海蜇等钵水母横裂生殖的分子调控机制提供了基础数据。