患病与健康杂色鲍苗中弧菌胞外产物的比较分析

本实验室于2004年采样自广东深圳下沙鲍鱼场变白掉板杂色鲍苗以及官湖养殖场健康鲍苗,各分离到16和34株弧菌,并对其胞外产物进行了比较分析。结果表明,官湖场健康鲍苗弧菌与下沙场患病鲍苗弧菌相比,前者20.59%(7株)菌株虽不分泌胞外酶但具溶血活性,余之菌株(64.71%,22株)或分泌酶和/或具溶血活性,但同时兼具蛋白酶、明胶酶、卵磷脂酶、脂肪酶和溶血活性的极少(5.88%,2株);后者则所有菌株均分泌胞外酶和/或具溶血活性,25.00%(4株)菌株能分泌四种酶及具溶血毒性,其余菌株(68.75%,11株)可分泌多种酶和/或具溶血活性。结果揭示,下沙鲍鱼场患病鲍苗弧菌分泌胞外酶和具溶血活性的能力明显强于官湖场健康鲍苗弧菌的,同时认为菌株X99-2和X100-8与下沙鲍苗病害潜在相关。     

刺参肠道微生物组成分析及产酶、溶血性试验

对野生和人工养殖刺参的肠壁及内容物中的菌群数量、种类组成进行了研究;并结合产酶试验和溶血性试验,对刺参肠道益生菌做了初步的体外筛选。结果表明,野生刺参肠壁及内容物中的细菌数量分别为(3.30±0.41)×107 cfu/g、(6.39±0.32)×107 cfu/g,养殖刺参肠壁及内容物中的细菌数量分别为(2.83±0.31)×107 cfu/g、(5.67±0.53)×107 cfu/g。野生刺参肠道优势菌为弧菌属(Vibrio),次优势菌为假单胞菌属(Pseudomonas)和希瓦氏菌属(Shewanella);养殖刺参肠道优势菌为弧菌属(Vibrio),次优势菌为假单胞菌属(Pseudomonas)。在224株细菌中,共有160株细菌具有产酶能力,所占比例为71.43%,其中具产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶能力菌株分别为114株、114株、108株,所占比例分别为50.89%、50.89%、48.21%。99株细菌中有23株具有溶血性,所占比例为23.23%。综合分析实验数据,确定6株细菌作为刺参肠道潜在益生菌,菌株代号分别为HS1(Pseudomonas)、HS5(Bacillus)、HS7(Shewanella)、HS8(Vibrio)、HS10(Vibrio)、HS11(Vibrio)。     

虾池养殖环境有机污染物降解细菌的筛选

在实验室条件下通过富集培养共分离出 1 2 1株菌进行筛选。利用需氧性、BOD2 / COD0 、胞外酶等指标进行筛选 ,最后筛选到 7株对富营养有机物具有较高降解能力的细菌 ,它们均能产生酪蛋白酶、明胶酶、脂酶 (Tween- 80 )、淀粉酶其中 4株细菌还能产生卵磷脂酶。通过测定 BOD5及 COD来衡量 7株细菌利用对虾饵料的能力 ,5d内对虾饵料培养基的 CODMn去除率达到 59.6%～ 79.2 %。用常规生理生化方法将细菌鉴定到属 ,其中 1株为弧菌属细菌 (Vibrio spp.) ,6株为芽孢杆菌属细菌(Bacillusspp.)。     

刺参肠道与养殖池塘环境中异养细菌和弧菌数量周年变化

2008年9月~2009年10月,对刺参肠道与养殖环境中异养细菌和弧菌周年变化进行了初步研究。结果表明:刺参肠道与养殖环境中(水体、底泥、附着基)异养细菌数(HPC)、弧菌数(VBC)均呈现出明显的季节变化,肠道中HPC、VBC分别为1.85×105~2.17×109CFU/g、4.1×104~2.2×108CFU/g,水体中HPC、VBC分别为90~4.67×105CFU/mL、0~5.3×103CFU/mL,底泥中HPC、VBC分别为9.80×104~6.72×106CFU/g、1.01×104~5.75×105CFU/g,附着基中HPC、VBC分别为2.78×105~2.57×107CFU/g、4.6×104~1.31×107CFU/g,夏、秋两季细菌总数较高,冬、春低温季节细菌数量显著下降。通过VBC与HPC的比值可以看出,在冬、春季细菌总数较低的季节,弧菌与异养细菌数量比例较高,最高值达到:43.8%、43.2%,通过对优势菌的分离鉴定,冬、春两季灿烂弧菌(Vibrio splendidus)均占优势,这可能是造成冬、春两季刺参发病的诱因之一。本文通过研究刺参肠道与养殖环境中异养细菌和弧菌的变化规律,以期为刺参的健康养殖提供有益参考。     

南大西洋热液区沉积物可培养细菌的多样性分析和产酶活性鉴定

为获得深海可培养微生物资源,利用2216E培养基,采用涂布平板法从南大西洋热液区沉积物中分离可培养细菌,并通过16S rRNA基因进行分类鉴定.同时测定各菌株产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、木聚糖酶、褐藻酸酶和脂肪酶(三丁酸甘油酯和吐温80)的能力.分离共获得216株菌株,经16S rRNA基因序列比对,共获得71株不同的菌株.其中包括变形菌纲62株、放线菌纲3株、芽孢杆菌纲2株和拟杆菌纲4株,分布于27个属,41个种.酶活检测结果显示,具有淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶(底物为三丁酸甘油酯)和脂肪酶(底物为吐温80)的产酶细菌分别为18、14、25、32株,供测细菌中未检出产果胶酶、木聚糖酶和褐藻酸酶的菌株.这些菌株为进一步研究开发提供了深海微生物资源.     

细菌胞外酶活性的调控因素

水生环境中的有机物大多（＞９５％）以高分子聚合物的形式存在，它们是水生异养细菌的主要碳源及能量来源。这些高聚物只有通过胞外酶水解成小分子单体或低聚物才能被细菌等异养微生物用以维持新陈代谢。这一生化过程是调节海洋有机营养平衡的重要生态因子，又是众多异养微生物赖以生存的基础。胞外酶活性不但能够指示水生环境中有机物的数量和质量，而且还能对此环境中流过微食物环的物质通量进行估计。胞外酶的水解作用是细菌生长中的一个速度限制步骤，胞外酶也正是许多海区中细菌生长所必不可少的。对于自然水体、人工条件及沉积物环境…     

仿刺参(Apostichopus japonicus)肠道菌群的地域性差异与共性研究

作为高附加值水产养殖物种,仿刺参(Apostichopusjaponicus)的病害和病原微生物研究受到人们关注,但对其共生菌群组成、地域性差异及与水体环境间交流等方面的研究仍十分有限。本研究收集了来自中国、日本和韩国共786例仿刺参肠道、水体和沉积物的16SrRNA基因高通量测序数据,比较细菌群落组成以探寻仿刺参肠道微生物与环境和地域之间的关系。分析结果显示,尽管仿刺参肠道、水体和沉积物中各细菌组分的比例不同,但共有菌属甚多,表明仿刺参可以从外界环境大量获取微生物。与水体和沉积物的样本类型相比,仿刺参肠道微生物多样性最低且所含菌属的种类最少,进一步提示仿刺参肠道对外界来源的微生物进行了富集和筛选,其中变形细菌门(Proteobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)和利斯顿氏菌属(Listonella)的富集尤为明显。中国、日本和韩国来源的仿刺参肠道微生物Alpha多样性无显著差异,但主坐标分析将它们聚为不同的簇,且各自拥有独特的细菌门类。比较中国渤海和黄海两个海区的仿刺参肠道菌群获得了相似的结果,体现出广泛的地域性差异。基于细菌分类的功能预测发现三个国家仿刺参肠道微生物均具有发酵、化能异养和需氧化能异养功能,表明共生菌群在功能上存在共性,并可能对宿主生理产生相同的作用。本研究揭示了仿刺参肠道微生物在不同地域之间存在明显差异,并且与水体环境之间存在着密切的联系,能够为仿刺参共生微生物及其与宿主健康的相关性研究提供基础性资料,并可能在自然循环过程和渔业资源保护过程中发挥作用。     

禁食对大黄鱼幼鱼消化酶活性的影响研究

为了研究饥饿对大黄鱼(Larimichthys crocea)幼鱼体内消化酶活性的影响,以540尾40g左右的大黄鱼幼鱼为研究对象,分成6组(S0、S4、S8、S12、S16和S20),每组3个平行,分别禁食0、4、8、12、16和20d,禁食结束后每组取样9尾,每个平行3尾,测定并分析胃和肠道中消化酶(蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶)活性。研究显示,禁食4d,胃和肠道中消化酶活性均出现较大幅度的降低(低于对照组28.32%~71.85%),随着禁食时间的延长,胃和肠道内3种消化酶活性均不同程度升高。在禁食4~20d时,胃内消化酶活性总体呈上升趋势,蛋白酶和脂肪酶活性在禁食16d时高于同期对照组,淀粉酶活性在禁食20d时高于同期对照组。肠道内消化酶活性呈先上升后下降趋势,其中,脂肪酶和淀粉酶活性在禁食8d时达到最高,蛋白酶活性在禁食12d时达到最高。禁食过程中,胃中蛋白酶活性始终高于肠道,但禁食过程中其变化幅度(-6.71%~63.72%)小于肠道(-64.79%~71.85%);脂肪酶和淀粉酶活性低于肠道,脂肪酶活性变化幅度(-62.88%~29.91%)小于肠道(-232.17%~46.28%),而淀粉酶活性的变化幅度(-81.71%~36.92%)大于肠道(2.35%~45.41%)。因此,与肠道相比,胃中蛋白酶和脂肪酶活性受到禁食的影响较大,淀粉酶活性受到的影响较小。此外,胃和肠道中淀粉酶活性均小于蛋白酶和脂肪酶。研究结果表明,脂肪酶和蛋白酶是大黄鱼幼鱼受到饥饿胁迫时参与代谢活动的主要酶类,而淀粉酶为从属酶类。本研究阐明了大黄鱼幼鱼饥饿过程中,体内消化酶活性的变化情况,为科学合理的投喂和大黄鱼的健康养殖提供了理论指导。     

半滑舌鳎病原鳗利斯顿氏菌表型及分子特征研究

2008年12月,江苏赣榆某渔场养殖半滑舌鳎出现大量死亡,症状主要表现为:头部、鳃盖及鳍基出血,尾鳍腐烂,腹腔膨胀并积有大量腹水,部分病鱼肠管脱出肛外。从病鱼肝脏、腹水中分离出大量优势生长的细菌,人工感染试验证明其对半滑舌鳎有较强的致病性。对3株分离菌进行了形态特征、理化特性、胞外酶及溶血素活性等表型生物学性状检验;测定了代表菌株的16S rRNA和gyrB基因序列,分析了16S rRNA和gyrB两种基因序列的同源性,并构建了系统发生树,比较了两种基因对分离菌的鉴定能力;结果表明gyrB基因用于细菌种间鉴定更具优越性;基于16S rRNA和gyrB基因的系统发育学分析表明分离菌与鳗利斯顿氏菌具有高同源性,根据分离菌的表型及分子特征,判定分离菌为利斯顿氏菌属(Listonella MacDonell and Colwell 1986)的鳗利斯顿氏菌[Listonella anguillarum (Bergeman 1909) MacDonell and Colwell 1986]。胞外酶活性及溶血活性检测表明3株分离菌均具有淀粉酶、蛋白酶、卵磷脂酶等胞外酶活性,在含7%家兔脱纤血液营养琼脂培养基上呈β型溶血,PCR检测3株供试菌均可扩增出大小约493 bp的溶血素基因和大小约248bp的金属蛋白酶基因。分离菌的耐药谱测定结果显示,对供试49种抗菌药物中的青霉素G等13种药物耐药,对羧苄青霉素等6种药物存在敏感与耐药的株间差异。     

哈维氏弧菌密度感应系统对几种胞外酶的活性影响

密度感应系统是细菌通过感受群体密度变化而控制基因特定表达的1种机制。对病原菌密度感应系统的研究有助于找到新的抗感染策略。目前哈维氏弧菌分泌的蛋白酶、脂酶、磷脂酶和溶血素等致病相关因子是否受密度感应系统的控制尚不清楚。哈维氏弧菌有3个平行的密度感应系统。本研究通过检测3个密度感应系统基因突变株的胞外酶(如蛋白酶、脂酶、磷脂酶和溶血素等)活性,发现明胶酶的活性受密度感应系统的信号分子HAI-1和AI-2的正控制,且受AI-2的控制程度更大;脂酶也在一定程度上受HAI-1和AI-2的正控制;卵磷脂酶受HAI-1的负控制;溶血素受HAI-1和AI-2共同的负控制。结果表明,哈维氏弧菌胞外分泌的几种毒力相关因子都受密度感应系统的调控,但控制方式各不相同。     

The effect of low-level kelp supplementation on digestive enzyme activity levels in cultured abalone Haliotis midae fed formulated feeds

Previous studies have found that macroalgal inclusion in formulated diets for cultured abalone improves feed utilisation, and it was suggested that seaweed-associated bacteria supply enzymes that aid in the animal's digestion. In the present study, we hypothesised that kelp supplementation in formulated feed affects the profile of digestive enzymes in farmed Haliotis midae. Commercially reared sub-adult abalone fed a kelp-supplemented (Ecklonia maxima; 0.88% dry weight) or kelp-free control feed were collected for analysis of the amylase, alginate lyase, laminarinase, fucoidanase and protease activities in the gut. Levels of polysaccharidase and protease activity did not significantly differ between the diet treatments. However, enzyme-activity levels were more variable in abalone fed the kelp-free diet as compared with those fed the kelp-supplemented diet (coefficients of variation: 73%, 48.3–60.2% and 31.9% [control diet] versus 42.7%, 13.6–33.8% and 14.6% [KS diet] for amylase, macroalgal polysaccharidases and acid protease activity, respectively). We suggest that the presence of dietary kelp modulates the abalone's gut bacteria and their nutrient exchange. Proteomic identification of proteins in abalone gut sections showed that exogenous enzymes associated with the gut microbiome aid in bacterial utilisation of digested molecules, whereas abalone endogenous enzymes degrade the macronutrients in formulated feeds.     

我国近海中度嗜盐菌的分离筛选及其产酶多样性分析

为了解我国近海中度嗜盐菌系统发育多样性及产酶特性,从天津、山东、江苏、福建、海南等地近海采集样品为研究对象,分离筛选得到108株中度嗜盐菌,其中有26株至少产一种酶。通过对其形态特征、生理生化、16SrRNA基因序列及系统进化树进行分析,将26株菌鉴定为细菌域的Halomonas、Idiomarina、Virgibacillus、Pontibacillus、Oceanobacillus、Halobacillus和Marinilactibacillus属的菌株。它们与相应属的模式菌株16SrRNA基因序列相似性在97%~100%不等,其中有些菌株可能代表不同的分类单元。底物特异性试验表明,分离的26株中度嗜盐菌13株产蛋白酶,19株产淀粉酶,13株产酯酶,4株产纤维素酶。其中6株产3种酶,11株产2种酶。研究结果表明中度嗜盐菌具有系统发育和产酶多样性,同时蕴藏着较多新的微生物类群,为嗜盐微生物资源应用开发提供了参考。     

半滑舌鳎仔稚鱼消化酶活性的变化

对半滑舌鳎不同发育阶段主要消化酶（酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）以及与消化吸收相关的碱性磷酸酶的活性变化进行了测定。结果表明，半滑舌鳎在仔鱼发育早期即可检出酸性蛋白酶和碱性蛋白酶的活力，碱性蛋白酶的2个极低值分别出现在仔鱼开口期和仔稚鱼的转交期，从孵化后23d左右胃腺出现时，酸性蛋白酶的活性开始明显升高。早期仔鱼体内表现出较强的淀粉酶活性，孵化后12d其活性急剧下降，并一直保持较低的比活力状态。脂肪酶的活性在半滑舌鳎早期仔鱼体内一直较低，进入稚鱼期后开始缓慢上升。碱性磷酸酶活性在变态结束后出现大幅度的升高，这标志着肠组织结构和肠道消化功能的完善。     

九孔鲍肠道及其养殖水体中弧菌抗药性的研究

为更好地防治鲍鱼病害的发生和流行,我们对分离自广东汕尾粤顺鲍鱼养殖场九孔鲍肠道及其养殖水体的弧菌菌株的耐药性进行了研究。对所分离鉴定的菌株进行了16种抗生素药物敏感性试验。结果表明,对绝大多数分离的菌株,四环素、青霉素G、卡那霉素、丁胺卡那霉素和新生霉素都不敏感或无作用,氟哌酸、红霉素、氯霉素以及环丙沙星等则均比较敏感：复方新诺明、链霉素和多粘霉素B对所有所实验的菌株均有作用。     

养殖石斑鱼溃疡病病原哈维氏弧菌胞外产物的研究

以网箱养殖的患溃疡病青石斑鱼(Epinephlus awoara)和斜带石斑鱼(Epinephlus co-ioides)分离的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)TS-628菌株为研究对象,采用平板玻璃纸覆盖技术,获得该菌株的胞外产物(ECP),并对其成分进行分析。利用杯碟法研究表明,哈维氏弧菌TS-628菌株的胞外产物具有酪蛋白酶、明胶蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、卵磷脂酶等多种酶活性和溶血活性,且溶血性物质具有热不稳定性。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及考马斯亮蓝R-250染色分析表明,ECP蛋白条带主要集中在分子质量范围25.0~66.2 ku之间,经不同时间培养所获得的ECP在凝胶上显示出的蛋白条带几乎一致。采用复性电泳方法(G-PAGE)分析了哈维氏弧菌及其它4种弧菌属细菌的ECP蛋白酶活性,结果发现哈维氏弧菌ECP在酸性条件下,蛋白酶活性较强,在碱性条件下,蛋白酶带明显减少,活性很弱。在相同的pH条件下,5种弧菌中以副溶血弧菌的ECP蛋白酶活性最强,种类多,分子质量范围宽;而哈维氏弧菌的蛋白酶带较少,活性也稍弱。     

牡蛎体内及其养殖水体中细菌耐药性研究

为进一步了解牡蛎体内外细菌的耐药性，对分离自阳江的香港牡蛎（Crassostrea hongkongensis）养殖水体及其内脏团的637个异养细菌进行了10种抗生素的药敏试验。采用纸片扩散法（Kirby-Bauer，简称K-B），参照NCCLS抗生素敏感试验操作标准，研究细菌的耐药概况。结果显示：健康牡蛎体内细菌对恩诺沙星和庆大霉素耐药率较低，发病牡蛎体内细菌对庆大霉素耐药率最低，次之为复合磺胺和恩诺沙星；水体细菌对氯霉素、恩诺沙星、环丙沙星耐药率较低，水体及体内细菌对呋喃唑酮耐药率最高，而对卡那霉素及青霉素耐药率则波动较大。结果还显示，不同来源的受试菌株多重耐药状况严重，来源于健康和病牡蛎的菌株在7月份的多重耐药率达到峰值，分别为66.7%和64.3%，养殖水体细菌多重耐药率峰值出现在4月份，最高达76.7%。总体来看，源于牡蛎养殖环境水体及其牡蛎体内的异养菌多重耐药比例较高，值得引起注意。而受试菌株对不同药物的抗性存在较大差异，且异养细菌对呋喃唑酮的耐药率明显高于对其它受测抗生素的耐药率。从时间动态上看，水体菌耐药率峰值出现于4月份，而牡蛎体内菌群耐药率峰值出现于7月份。     

饥饿和再投喂对千年笛鲷幼鱼消化酶活性的影响

研究了饥饿和再投喂对千年笛鲷(Lutjanus sebae)幼鱼消化酶活性的影响.实验设计分成6组,分别饥饿处理0(对照),2,4,6,9和11 d,然后在饱食的条件下恢复投喂10 d.分别测定饥饿和恢复投喂过程中千年笛鲷幼鱼蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶3种消化酶的活性.结果表明,在饥饿过程中,蛋白酶和脂肪酶活性下降明显,淀粉酶起伏较大;恢复投喂后,蛋白酶和脂肪酶活力与饥饿前相比都有所上升,但蛋白酶活力总体上仍低于同步取样对照组,脂肪酶活力总体上高于对照组水平,淀粉酶活力恢复到对照组水平,并且基本上没有变化.