大黄鱼肌肉组织cDNA全长文库的构建及EST分析

以大黄鱼肌肉组织为材料,利用Creator Smart cDNA Library Construction Kit构建了大黄鱼肌肉组织的全长cDNA文库.文库质量分析表明：cDNA文库容量不低于1.68×106cfu/mm3,重组率达96%,插入片断的平均长度大于1 000bp.随机挑取512个cDNA克隆进行5’端测序,其中430条ESTs的长度大于100bp;并初步拼接得到了230个单基因簇（unigene）,其中包括58个重叠群（contigs）,172个单拷贝ESTs（singletons）,冗余度为46.51%.经检索,35个ESTs在BLASTx上无明显的同源性（E值≤1.00×10-10）,为新基因.195个ESTs与已报道的基因有较高的同源性;其中与能量相关基因的ESTs丰度最高,占总数的20.00%.蛋白质合成、细胞骨架和信号传导次之,比例分别为13.48%、12.17%、10.00%,其中包括高迁移率族蛋白B1、瘦素受体、β1-热激蛋白等.这些EST数据为进一步筛选和克隆大黄鱼肌肉特异性表达基因提供了平台.     

曼氏无针乌贼肌肉cDNA文库的构建和表达序列标签分析

以曼氏无针乌贼（Sepiellamaindroni）肌肉组织为研究材料,利用Clontech公司的cDNA文库构建试剂盒构建了曼氏无针乌贼肌肉cDNA文库．对文库质量的分析结果表明：cDNA文库的库容量约为1．2×10。克隆（cfu／dm^3）,重组率达96％,插入片段平均长度大于l000bp．挑取568个阳性克隆进行5’末端测序,其中475条ESTs长度大于100bp,初步拼接后得到200个单基因簇,包括41个重叠群和159个单拷贝EST,冗余度为57．89％．经检索,53条ESTs（占比为26．5％）在BLASTx上无明显的同源性（E值≥1．00×10^-10）,为新基因．147条ESTs（占比为73．5％）与已报道的基因有较高的同源性;其中与能量相关基因的ESTs丰度最高,占总数的23．0％．细胞信号传导、细胞骨架和蛋白质代谢的次之,比例分别为17．5％、12．5％、9．5％,其中包括热激蛋白70、转铁蛋白等．这些EST数据有助于进一步筛选和克隆曼氏无针乌贼和其他头足动物的肌肉特异性表达基因．     

东海原甲藻cDNA文库构建及尝试性EST分析

东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)是中国沿海频繁发生的大规模赤潮的原因种之一,大规模分离鉴定东海原甲藻功能基因是理解东海原甲藻赤潮形成过程和机理的重要基础。取对数生长期藻体,经微量总RNA抽提、cDNA合成、cDNA扩增和克隆等步骤,构建了东海原甲藻cDNA文库并进行了尝试性表达序列标签分析。从含有约5000个转化子的文库中随机取150个测序,获得126条EST序列。经网上BlastN及BlastX分析,共发现11个是已知功能的基因的标签。这些基因与东海原甲藻生长发育、物质转换和能量代谢相关。     

南移养殖的刺参(Apostichopus japonicus)cDNA文库的构建及原肌球蛋白基因的研究

以南移养殖的刺参为实验材料,采用非均一化的Oliga-dT引物定向克隆技术构建了南移刺参混合组织的cDNA文库。对文库质量的分析结果表明,cDNA文库的库容量为2.2×107cfu,重组率达95.8%,平均插入片段长度750bp左右。挑取cDNA克隆进行5’端测序,成功测序185个反应,分析得到136个单基因簇(Unigene),其中包括40个重叠群(Contigs)、96个单拷贝EST(Singletons)。结果表明,克隆南移养殖的刺参原肌球蛋白(tropomyosin,Trp)cDNA全长序列为1112bp,ORF编码284个氨基酸,其预测蛋白的分子量为33.27kDa,等电点为4.56。该氨基酸序列与紫石海胆、南极大磷虾、锯缘青蟹、文昌鱼、河蟹、家蚕同源性分别为62%、51%、46%、49%、47%、46%。     

中国对虾6种组织cDNA文库的构建

以中国对虾血液、眼柄、卵巢、雌虾头胸部、雄虾头胸部和三倍体对虾头胸部组织为材料,采用异硫氰酸胍-酸酚法提取总RNA;用磁珠法纯化mRNA;用Uni ZAP cDNA合成试剂盒合成双链cDNA并进行修饰,将cDNA定向连接在UniZAP载体上;经Gigapack Gold Package包装试剂盒包装成为噬菌体颗粒,转染宿主XL1 Blue MRF’菌株细胞,形成初级文库.初级文库经转染进一步扩增,形成稳定的cDNA文库.6个文库的库容在0.2×106~1.3×106之间,重组率都超过90%.从各文库随机取出6~10个清晰的噬菌斑进行PCR扩增,用琼脂糖凝胶电泳检测,其插入片段长度为500~2500bp.由初步功能基因克隆获得阳性结果.多项指标表明,所构建的对虾cDNA文库质量较高,为进一步筛选目的基因、EST测序和制作基因芯片提供了有效的工具.     

青蛤(Cyclina sinensis)cDNA文库构建及免疫相关因子基因的筛选

在鳗弧菌侵染下,利用SMART方法构建了青蛤的cDNA文库,并采用高通量测序方法和BLASTX比对筛选出ESTs及免疫相关因子的基因.结果表明,所构建的cDNA文库的库容量为1.12×106,插入片段均在500bp以上;大于100bp的有效ESTs序列1113条,平均长度725bp,拼接后获得一致性序列420条,其中包括126个叠联群和294个单拷贝EST,BLASTX比对后获得注释序列271条,进一步筛选获得青蛤免疫相关因子基因序列45条,为克隆其免疫防御相关因子的基因提供了重要的基础.     

日本绒螯蟹线粒体DNA序列研究Ⅱ.16S rRNA

参考果蝇、卤虫与锯缘青蟹的线粒体 DNA16 S r RNA基因序列进行了日本绒螯蟹相同基因片段的引物设计、PCR扩增及序列测定 ,得到 56 7bp的碱基序列 ,其 A、T、G、C含量分别为194 bp(34.2 2 % )、2 16 bp(38.10 % )、98bp(17.2 8% )、59bp(10 .4 1% ) ,与果蝇、卤虫及锯缘青蟹类的 16 S r RNA基因片段序列含量相似。     

副溶血弧菌感染的九孔鲍血细胞均一化全长cDNA文库的构建

采用Trizol试剂提取副溶血弧菌感染的九孔鲍血细胞的总RNA,经Oligotex纯化得到mRNA.根据SMART技术原理合成双链cDNA.双链cDNA采用双链特异核酸酶进行cDNA的均一化,构建成九孔鲍血细胞的均一化全长cDNA文库.原始文库的库容为3.4×106 cfu/cm3,重组率为92.3%,扩增后文库的滴度为2.6×1011 cfu/cm3以上.从文库中随机挑取897个克隆,测序获得高质量ESTs814条,其中有23条Contigs; 762条Singlets,Unigenes共785条,冗余率只有3.56%.以上结果说明所构建的文库质量好,完全可以满足后续基因克隆和表达序列标签测序工作的需要.     

牙鲆dmrt1 基因的克隆及其与P450arom 基因的组织表达分析

通过基因组步移和3’RACE获得了牙鲆(Paralichthys olivaceus)dmrt1的cDNA全序列,该基因开放阅读框全长909bp,其编码的蛋白具有高度保守的DM结构域,5’UTR区含有性别相关转录因子Sox9和Sox5的结合位点。牙鲆dmrt1基因只在牙鲆的性腺中表达,且在精巢中的表达明显高于卵巢,表明牙鲆的dmrt1可能是一种性别相关基因。同时,对牙鲆的另一性别相关基因P450arom在成体各组织的表达分析结果表明,该基因除在牙鲆的性腺中有表达外,在肾脏、脾脏、鳃和脑等其他组织中也有不同程度的表达。牙鲆P450arom基因在性腺中的表达也存在两性差异,其表达模式与dmrt1的正好相反,在卵巢中的表达量明显高于精巢。     

Gene discovery in the tropical scallop Nodipecten nodosus: Construction and sequencing of a normalized cDNA library

We report the construction and characterization of a normalized cDNA library from the digestive gland of the marine bivalve Nodipecten nodosus, a commercially valuable tropical scallop. A total of 288 clones were sequenced, and 250 unique sequences were obtained. The cDNA library showed a small sequence redundancy (2.3%) and high numbers of recombinant (99.9%) and independent clones (2.0 × 10⁶ cfu), indicating that the cDNA library generated in this study is a profitable resource for efficient gene discovery for N. nodosus. EST functional annotation by Gene Ontology term assignment revealed the identification of sequences potentially involved in aquaculture and ecotoxicology relevant processes such as apoptosis, growth, lipid metabolism, reproduction, development, response to stress and immunity.     

刺参肌肉组织cDNA文库的构建

用RNA提取试剂--TRIZOL Reagent提取刺参(Apostichopus japonicus)肌肉组织总RNA,用SMART cDNA Library Construction Kit构建cDNA文库.经测定原始文库滴度达到 3.2×10~6,扩增后文库滴度达到 5.1×10~9,重组率达到96.7%,从扩增文库随机挑取12 个克隆进行PCR 扩增鉴定,结果显示,插入片段大小为0.5～2.5 kb.通过各项指标验证成功构建了刺参肌肉组织cDNA 文库.     

锯缘青蟹幼体饵料蛋白质的营养价值评价

本文分析测定了锯缘青蟹幼体从刚孵化至大眼幼体各发育阶段及其饵料轮虫和卤虫无节幼体的氨基酸组成，并使用必需氨基酸指数(EAAI)来评价饵料蛋白质的质量.结果表明，青蟹各期幼体的氨基酸组成基本趋于一致，且与饵料转换不存在明显的相关性.对于各期幼体，饵料轮虫和卤虫无节幼体的必需氨基酸指数均大于90，可以认为，轮虫和卤虫无节幼体能够满足锯缘青蟹幼体对饵料中必需氨基酸的营养需求.     

锯缘青蟹幼体性分化的解剖学及组织学实验研究

锯缘青蟹（Ｓｃｙｌｌａ ｓｅｒｒａｔａ［Ｆｏｒｓｋａｌ］）背甲宽×长为２．３×１．５ｃｍ的幼蟹，其上部性征已开始发生分化，雌性个体腹部宽度增大，副性征也有胆显的差异，在雄性个体腹足呈单肢型而雌体呈双肢型。但是，在幼蟹生殖腺仍见不到组织学上的差异。腹部肢是分辨幼蟹性别是为直观，适宜的指标。本文还讨论了青蟹两性生殖系统形态结构及其功能上的差异问题。