溶藻弧菌的PCR快速检测方法

为建立溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的PCR快速检测方法,本研究根据弧菌toxR基因的高变区序列设计1对扩增片段为161 bp的引物,进行了特异性和敏感性试验.结果表明该方法能特异地检测溶藻弧菌,每个PCR反应检测的敏感度为0.01 pg的DNA和3.7CFU的细菌.用溶藻弧菌人工感染大菱鲆,以建立的PCR方法检测感染鱼的肝、脾、肾阳性检出率为100%.该方法可用于对感染溶藻弧菌的水生动物疾病进行诊断.     

罗非鱼源无乳链球菌（Streptococcusagalactiae）Sip基因的克隆、鉴定及分子特性分析

利用设计的特异性引物,扩增出了分离自患病罗非鱼无乳链球菌强毒株Sip基因,并将其克隆到pMD19-T载体上,之后对重组质粒进行了PCR和双酶切（BamHⅠ＋HindⅢ）鉴定,并利用多种生物信息学软件对Sip基因进行分子特性分析。结果显示,罗非鱼源无乳链球菌Sip编码氨基酸序列具有极高保守性,与人源、哺乳动物源无乳链球菌...     

香鱼(Plecoglossus altivelis)养殖群体遗传多样性的AFLP分析及性别特异性分子标记筛选

采用扩增片段长度多态性(AFLP)技术分析了香鱼(Plecoglossus altivelis)养殖群体的遗传多样性,并筛选性别特异性分子标记。结果表明,15对选扩引物组合共扩增到889个位点,其中多态性位点380个,多态率为42.74%;群体Nei氏遗传多样性指数为0.1454,Shannon氏指数I为0.2174。香鱼养殖群体的遗传多样性较丰富,处于中等偏上水平。仅引物组合E-ATG/M-CTG扩增到1条雄性特异性条带,长度为139bp。以该雄性特异性AFLP条带的DNA序列为模板,设计1对特异的PCR引物并在10尾已知性别的香鱼(雌雄各5尾)中扩增检验,结果显示5尾雄鱼均可扩增到目的条带而5尾雌鱼均无扩增。表明该序列是雄性特异性分子标记,可用于鉴别香鱼的遗传性别,并为香鱼的性别决定机制和性别控制研究奠定基础。     

橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼的AFLP分析

运用AFLP分子标记技术检测了橙色莫桑比克罗非鱼（Oreochromis mossambicus）和荷那龙罗非鱼（Oreochromis hornorum）的种群遗传多样性。提取2种鱼的基因组DNA，经EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ限制性内切酶酶切并加接头，从16对选扩引物组合中选出3对扩增结果较好的引物进行PCR扩增。扩增产物经PAGE胶电泳、银染，检测其多态性。3对引物在2种罗非鱼的40个个体中共扩增出94条带，其中多态性条带76条，占总扩增条带的80．9％，2个群体的多态性条带比例分别为71．6％和52．4％。根据Nei氏（1978）统计分析得出橙色莫桑比克罗非鱼种群内遗传相似系数为0．765。荷那龙罗非鱼的为0，821，表明2个罗非鱼种群均具有较高的遗传多样性，橙色莫桑比克罗非鱼种群内遗传多样性相对更高些。2种罗非鱼的种间遗传距离为0．279，推测该杂交组合可能具有杂种优势。     

间接ELISA技术在病原性鳗弧菌SMP1快速检测中的应用

以大菱鲆(Scophthalmus maximus)出血症的病原菌——鳗弧菌(Vibrio anguillarum)SMP1为抗原,制备兔抗血清,测定了抗血清的工作浓度和对抗原的特异性,建立了在大菱鲆肝肾组织中检测SMP1的间接ELISA方法。SMP1人工感染大菱鲆,用建立的间接ELISA对大菱鲆肾脏和肝脏进行检测,结果肾脏的阳性检出率为87.7%,肝脏的阳性检出率为90%。该方法的建立有助于快速准确地鉴定由SMP1引起的大菱鲆疾病。     

饲料蛋白水平对奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus × O. aureus)生长、免疫功能以及抗病力的影响

采用单因素实验设计方法,进行了饲料蛋白水平对奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus×O.aureus)生长、免疫功能和抗无乳链球菌能力影响的研究。结果表明,饲料蛋白水平对奥尼罗非鱼生长和饲料利用率以及成活率不产生显著影响,蛋白质效率和蛋白质沉积率伴随着蛋白水平的升高显著下降。35%(D35)饲料组奥尼罗非鱼肝脏过氧化氢酶含量显著高于其它饲料组,然而奥尼罗非鱼肝脏溶菌酶、超氧化物歧化酶活性以及丙二醛含量并不受饲料蛋白水平的影响。无乳链球菌攻毒实验结果表明,蛋白水平对奥尼罗非鱼在攻毒后24h和48h后的累积死亡率是不存在显著影响。本实验的结果表明,24.8%(D25)蛋白水平饲料能够满足奥尼罗非鱼正常生长、以及维持机体正常的非特异性免疫功能和抗病力的营养需求。     

应用巢式逆转录聚合酶链反应检测鱼类病毒性出血性败血症病毒(VHSV)

参照鱼类病毒性出血性败血症病毒序列,根据PCR引物设计的原则,设计巢式PCR引物,采用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,对如何快速检测鱼类病毒性出血性败血症病的方法进行了较为系统的研究,并对RT-PCR的反应条件进行了优化.结果表明,巢式RT-PCR扩增获得279bp的特异性片断,阴性对照无扩增条带.巢式RT-PCR扩增出的特异性片段经测序分析,结果证实与报道的序列完全一致.该方法最低可检测出0.1pg的鱼类病毒性出血性败血症病毒RNA.初步建立了VHSV的巢式RT-PCR检测方法,该方法灵敏、特异,可为VHSV的检测提供一个快速、有效的手段.     

逆转录-PCR扩增文昌鱼LIM类同源框基因片段

于1997年6月在青岛市沙子口海域采集文昌鱼样品，采用RT－PCR方法进行青岛文昌鱼LIM类同源框基因片段的扩增研究。结果表明，用一对引物一次PCR扩增的方法未能得到特异的PCR产物，用一对引物两次PCR扩增的方法也同样未果。在对套式PCR进行研究时发现，用普遍PCR方法进行的套式PCR结果不够理想，而用三步两段法和四步两段法套式PCR则可进行成功的扩增。用这两种方法扩增的PCR产物具有高度特异性。相比之下，用简并的引物对未知的基因片段进行PCR扩增时，三步两段法和四步两段法的套式PCR应是首选方法。     

PCR检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)中假阴性的探讨

采用PCR、核酸探针斑点杂交、组织切片等方法研究了PCR检测白斑综合征病毒(WSSV)中的假阴性问题。设计了一对引物用于PCR检测WSSV,PCR扩增的产物长度为235bp,检出极限为0.1pg WSSV DNA。结果表明,PCR检测15例攻毒螯虾鳃样品时出现一例阴性,而经10—106倍稀释后的样品却呈现阳性,推断PCR出现了假阴性。核酸探针斑点杂交及组织切片结果表明注射WSSV的螯虾鳃组织确已被严重感染,进一步证实了PCR假阴性。根据PCR的检出极限及模板稀释梯度,推算出该PCR能成功扩增的引物与模板浓度的比例范围约为2.4×105—2.4×1010。     

波纹唇鱼微卫星分子标记的筛选及适用性分析

采用磁珠富集法及利用生物素标记的(CA)15寡核苷酸探针从波纹唇鱼(Cheilinus undulatus)基因组DNA Bsp143Ⅰ酶切位点的400~1000 bp片段中筛选CA/GT微卫星位点。洗脱的杂交片段克隆到PMD18-T载体上构建富集微卫星基因组文库后,通过PCR筛选出阳性克隆进行测序。在120条序列中有88条序列包含有重复次数不少于5次的微卫星位点,阳性序列比例达到73.33%。其中完美型(perfect)类型微卫星最多的重复次数为26次。在88条非冗长序列中,共有28条(31.82%)微卫星重复序列两端有侧翼序列能够进行引物设计。用波纹唇鱼3个个体的混合基因进行引物筛选,其中的24对具有清晰的扩增条带。将筛选的24对引物对波纹唇鱼1个群体的39个个体进行遗传多样性分析,其中4对引物扩增产物为单态,20对扩增产物呈多态性;20对扩增多态的引物在39个个体中扩增出等位基因数为2~12,平均有效等位基因数为3.5。该波纹唇鱼群体的PIC、Ho、He的平均值分别为0.0782、0.8513、0.5667。这20个微卫星位点适于波纹唇鱼群体遗传结构的研究分析。     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)岱衢洋选育群体和官井洋养殖群体的遗传差异分析

应用RAPD技术对大黄鱼岱衢洋选育群体和官井洋养殖群体的遗传差异进行研究,选取15条10bp随机引物,共检测出96个RAPD位点。结果表明,岱衢洋选育群体的多态位点比例为33.33%,平均杂合度为0.3008,Shannon多样性信息指数为0.0879,群体内个体间平均遗传相似系数为0.9079,平均遗传距离为0.0921;官井洋养殖群体的多态位点比例为43.75%,平均杂合度为0.3298,Shannon信息指数为0.1221,群体内个体间平均遗传相似系数为0.8784,平均遗传距离为0.1216。大部分遗传变异(93.52%)存在于群体内,少部分遗传变异(6.48%)存在于群体间。两群体间的Nei氏标准遗传距离为0.0123。以上分析表明,大黄鱼官井洋养殖群体的遗传多样性水平高于岱衢洋选育群体,但两个群体都处于较低的遗传多样性水平,需要对大黄鱼的种质资源进行科学管理和保护,以避免遗传多样性下降。     

一株大口黑鲈(Micropterus salmoides)虹彩病毒(Iridoviridae)的分离及鉴定

2018年7月,浙江省某大口黑鲈(Micropterus salmoides)养殖场暴发疑似病毒引起的疾病。现场采样发现,病鱼体长约15—20cm,鱼体于水面下暗游,反应迟钝,体表有出血点或溃疡症状。本研究通过采用鲤鱼上皮瘤细胞(epithelioma papulosum cyprinid, EPC)培养、超薄切片透射电镜观察、病毒主要衣壳蛋白(majorcapsidprotein,MCP)克隆与测序分析等方法,从患病大口黑鲈中分离得到一株病毒,鉴定其属于虹彩病毒科蛙病毒属,命名为大口黑鲈虹彩病毒宁波分离株(LMBIV-NB001)。EPC经患病鱼组织匀浆液接种后出现细胞圆缩、死亡、脱落等典型的细胞病变症状。将感染后的EPC细胞制作超薄切片,通过电镜观察发现,EPC细胞质中存在大量直径约120nm具囊膜的正六边形成熟病毒粒子,形态与虹彩病毒相似。根据虹彩病毒MCP基因保守区域序列设计特异性引物对病鱼组织样本进行PCR扩增,获得了1029bp的目的基因片段。将该扩增片段连入pMD19-T simple质粒后测序,经BLAST比对分析显示,其与GenBank中已报道的鳜鱼蛙病毒NH-1609、大口黑鲈溃疡综合征病毒BG/TH/CU3、EPC060608-08的MCP基因同源性最高,相似度均达到99.13%。构建系统进化树分析表明,本研究分离的LMBIV-NB001株与NC_038508、GU256635、MG941005等虹彩病毒科蛙病毒属毒株聚成一簇。本论文研究结果为不同地区蛙病毒属成员的起源和分化等相关研究等提供了基础材料。     

Diagnosis of iridovirus in large yellow croaker by PCR

A rapid and sensitive PCR-based method for the detection of the large yellow croaker iridovirus(LYCIV) is described,which involves the amplification of a 295 bp fragment of the LYCIV ATPase gene from DNA isolated from naturally infected fish spleen.Sequencing of LYCIV ATPase gene fragment showed it shared 100% nucleotide sequence homology with the corresponding region of the ATPase gene of red sea bream iridovirus(RSIV) and sea bass iridovirus(SBIV),suggesting that LYCIV was homologous with RSIV and SBIV at least in part of the gemone.The specificity and sensitivity of the PCR procedure were tested on the iridovirus-infected fishes,the expected fragment was detected from spleen DNA samples of infected fishes,whereas no fragments were amplified from healthy fish spleen DNA,white spot syndrome baculoviruses(WSBV) DNA and pseudorabies virus(PRV) DNA.Detection limit of this method was 10^-7 ng positive plasmid DNA containing target sequence,equal to about 100 virions.In the infected experiment,first positive detection(1/4) appeared at Day 3 post-infection,all fish(4/4) tested positive at Day 7,however obvious symptoms were observed at Day 8,so LYCIV infection could be detected prior to the appearance of obvious symptoms.These results indicate that this PCR method could be used for early,rapid and specific detection of LYCIV infection.     

流行性造血器官坏死病毒（EHNV）PCR快速检测试剂盒的研制

以流行性造血器官坏死病毒（EHNV）中的主衣壳蛋白基因保守区序列作为扩增靶序列,设计合成了一对特异性引物,应用快速的模板制备方法和优化PCR扩增条件,建立了EHNV病毒PCR快速检测技术,并开发成简便、快速、实用的检测试剂盒.该试剂盒的检测灵敏度相当于31个病毒粒子,模板制备时间约30 min,约4 h即可得到准确的结果;且无非特异性扩增带,适用于由EHNV病毒感染的鱼类苗种和水产品的检疫及水质环境的监测.     

尼罗系吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)幼鱼实用日粮中蔗糖糖蜜的养殖效果与血糖代谢变化

采用6种等蛋白质(34.4%)、等能量(16.10MJ/kg)试验日粮,研究了尼罗系吉富罗非鱼幼鱼实用日粮中蔗糖糖蜜替代小麦次粉的养殖效果与血糖代谢变化。结果表明,56d试验期间各试验组鱼均无死亡;蔗糖糖蜜替代小麦次粉40%—100%日粮组鱼的摄食量、特定生长率、饲料效益和蛋白效益均高于小麦次粉组鱼,当蔗糖糖蜜100%替代小麦次粉时,其摄食量、特定生长率和饲料效益蛋白效益比均显著性上升(P<0.05)。各试验组鱼鱼体营养成分(蛋白质、脂肪、灰分和水分)和肝体指数无显著性差异(P>0.05),肝脏结构正常。蔗糖糖蜜组鱼血浆中血糖、总蛋白、胆固醇、甘油三酯含量明显高于小麦次粉组鱼(P<0.05)。本试验结果认为,蔗糖糖蜜在尼罗系吉富罗非鱼幼鱼实用日粮中可以完全替代小麦次粉,蔗糖糖蜜对尼罗系吉富罗非鱼幼鱼具有较好的生长效益、节约日粮蛋白质效益和适口性,其主要原因与摄食蔗糖糖蜜后尼罗系罗非鱼幼鱼产生的较长时间高血糖现象有关。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)GnRHR基因全长cDNA 的克隆与组织表达分析

采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)方法, 克隆了半滑舌鳎中 GnRHR 全长 cDNA。通过基因全长以及推断的氨基酸序列分析, 得知该序列包含一个 7tm-1 保守结构域, 为 G 蛋白偶联受体家族成员。利用 PHYLIP 3.5c 邻位相连法以及 DNAstar 中的 CLUSTAL W 方法对相应的氨基酸序列进行了聚类分析和序列相似度分析。结果表明, 半滑舌鳎 GnRHR 鳉 与鲈鱼、琥珀鱼、虹鳟以及青 等鱼类中的 GnRHR聚为一支, 亲缘关系较近, 且相似度较高, 分别为 90.1%、 89.7%、 79.0%以及 78.3%, 而与高等哺乳动物人、小鼠相似性仅分别为 18.8%和 16.2%, 亲缘关系较远。应用半定量 RT-PCR 技术分析其组织表达, 发现 GnRHR 广泛表达于各个组织, 但表达量差异较大, 在性腺、脑和肾中表达量较高, 其它组织较弱。     

以16S和16S—23S rDNA间区为靶区建立副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) PCR快速检测技术

提要应用BLAST程序和DNAstar软件,比较分析了5株副溶血弧菌和其他细菌的16S—23S rDNA间区序列,选取IGSIA作为扩增靶区,结合相邻的16S rDNA序列,设计合成了一对特异性引物,通过优化扩增条件,建立了快速检测副溶血弧菌的PCR方法,对其特异性和敏感性进行了探讨,并初步进行了应用研究。结果表明,新建的PCR方法能特异性地扩增出大小为306bp和552bp的2条带,分别对应于副溶血弧菌的IGS0和IGSIA,检测灵敏度为5.6×102CFU/ml,半个工作日即可得到准确的结果,能有效检测出在杂色鲍、凡纳滨对虾和各种水质中的副溶血弧菌,适用于海洋水产动物副溶血弧菌病的早期快速诊断、水产品的检疫及水质环境的监测。     

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)幼体新暴发病病原阴沟肠杆菌的分离鉴定

2010 年, 浙江湖州部分罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)育苗场在幼体培育阶段, 暴发 了幼体大规模发病死亡的新病害。从2 个育苗场6 个发病育苗池的发病幼体匀浆液中分离得到6 株 优势生长菌株(编号为NTH01、NTH02、NTH03、316D、316X、316C), 菌落形态较为一致。取代表 菌株NTH01, 以浸泡方式进行人工回感, 结果菌株NTH01 能够导致幼体发病死亡, 且症状与生产表 现一致。经形态学观察、生理生化鉴定、16S rRNA 与gyr B 基因序列系统发育关系构建, 鉴定菌株 NTH01 为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae).以阴沟肠杆菌omp A 基因片段为靶序列, 建立了PCR 检测方法, 对另外5 株优势菌进行检测, 结果该5 株菌都是阴沟肠杆菌。2011 年, 对4 个发病育苗场 幼体与亲虾进行检测, 结果发病幼体中分离的优势菌检测呈阳性, 亲虾肝胰腺与肠道组织检测到该 菌存在, 但亲虾不表现病症。对30 种抗生素的药敏试验结果表明, 菌株NTH01 对恩诺沙星、氧氟 沙星、庆大霉素等6 种抗生素敏感, 对发病幼体进行针对性用药, 效果明显。本试验结果表明, 阴沟 肠杆菌是导致罗氏沼虾育苗期间幼体大规模发病死亡的致病菌。     

固定标本的DNA提取及PCR扩增

报道福尔马林、酒精固定的日本绒螯蟹标本的 DNA提取及 PCR扩增 ,并与冷冻、煮沸标本进行了比较。结果表明 ,福尔马林固定标本与酒精固定标本一样可以提取 DNA,加入的蛋白酶 K量越多 ,DNA的回收率越高。以提取的 DNA为模板 ,进行了线粒体 DNA12 S r RNA和 D- loop基因片段的 PCR扩增 ,经琼脂糖凝胶电泳 PCR扩增产物后均得到了与期待的碱基长度相一致的清晰谱带。     

锦鲤疱疹病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

研究建立并完善了Taqman实时荧光定量PCR检测锦鲤疱疹病毒（KHV）的方法。首先通过选取KHV病毒TK基因的保守序列（GenBank AB182940）,利用PRIMER EXPRESS 2.0设计引物和探针。其中Taqman探针的5’端标记FAM,3’端标记TAMRA。然后利用梯度稀释的阳性样品克隆质粒进行定量PCR反应,制作标准曲线,得到病毒拷贝数与Ct值的关系为：Ct=-3.45 lgX＋42.73（相关系数R2=0.989）。通过试验检测得到实时荧光定量PCR对KHV的灵敏度为32个病毒核酸拷贝数,同时,设计的引物和探针对于鱼类细胞系和其它鱼类病毒没有扩增反应,表现出较好的特异性。实验结果表明,实时荧光定量PCR检测KHV的方法,具有特异性好、灵敏度高的特点,可以缩短检测时间,提高检测速度,非常适合口岸进出口检验检疫的要求。