黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)“红头病”病原菌迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)的分离及鉴定

用ATB微生物自动鉴定系统对分离自湖南湘潭地区人工养殖的患“红头病”的黄颡鱼体内的2株细菌（即HN004和HN005）进行了鉴定，发现它们的生理生化特征完全相同，均为革兰氏阴性短杆菌、接触酶阳性、吲哚阳性、H2S阳性；氧化酶阴性、V．P测定为阴性，与迟钝爱德华氏菌的表型特征非常相似。为进一步确定2株菌的分类学地位，测定了其16S rRNA基因序列，分析了相关细菌相应序列的同源性，构建分子系统发育树。结果表明，2菌株的序列完全一致，与迟钝爱德华氏菌的亲缘关系最近，相似性为99．0％。综合上述结果，2菌株可鉴定为迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）。     

合浦珠母贝iPS细胞相关的转录因子的克隆及分析

转录因子Sox2、Oct4、c-Myc和KLF4在iPS细胞研究中具有重要作用,将它们加入体外培养的细胞中,可以诱导体细胞去分化成为多能干细胞。作者通过RACE-PCR技术从合浦珠母贝(Pinctada fucata)的外套膜组织中克隆获得了3个转录因子——c-Myc、Sox2及KLF4的cDNA。c-Myc全长1585bp,开放阅读框的长度为1131bp,编码376个氨基酸,蛋白结构分析表明它具有保守的HLH和Myc-N结构域。Sox2全长1908bp,开放阅读框长度为990bp,编码329个氨基酸,蛋白结构分析它具有保守的HMG-box和Soxp结构域。KLF4全长2268bp,开放阅读框长624bp,编码207个氨基酸,预测该蛋白具有两个zf-H2C2_2结构域。BLAST分析它们均与太平洋牡蛎的相关蛋白具有较高同源性,说明其与太平洋牡蛎亲缘关系更近。RT-PCR实验发现这3个基因在合浦珠母贝外套膜、足、生殖腺、内脏团、闭壳肌和鳃6种组织中均有表达,表明它们是非常保守的转录因子。本研究对于合浦珠母贝细胞系建立和研究具有启发意义。     

稀杯盔形珊瑚钙网蛋白基因的克隆及功能分析

钙网蛋白（calreticulin，CRT）是高度保守的内质网钙结合蛋白和分子伴侣，主要参与调节钙离子水平和指导蛋白质正确折叠。在这里，我们克隆稀杯盔形珊瑚（Galaxea astreata）的CRT基因，命名为Gacrt，并分析其促进细菌凝集的能力。Gacrt全长1792bp，其中5’端非翻译区(5''UTR)为77 bp，3’端非翻译区(3''UTR)为380bp，开放阅读框(ORF)1335bp，编码444个氨基酸残基，包含信号肽结构域、内质网检索信号序列（KDEL）、两条保守的钙网蛋白家族结构和一组三重复序列。通过构建原核表达系统得到CRT重组蛋白，纯化后的重组蛋白可以促进革兰氏阳性菌藤黄微球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌凝集，具有细菌凝集活性，支持GaCRT作为免疫相关分子参与机体对细菌防御的观点。     

绿海龟（Chelonia mydas）α-actin基因的cDNA克隆与序列分析

为探究绿海龟（Chelonia mydas）α-actin基因序列的相关信息,利用RT-PCR和RACE方法从绿海龟肌肉组织中获得了α-actin基因的cDNA全长序列,共1347bp（GenBank登录号为JX073650）。所得序列包含一个1134bp的开放阅读框,编码由377个氨基酸组成的蛋白,该蛋白7-377位为Actin结构域,14-17位有一个糖基化位点,无信号肽;预测分子量为42.0kDa,理论等电点为5.23。将编码区序列与GenBank上同源序列进行比对发现,核苷酸序列相似性均在85.4%以上,氨基酸序列相似性均在98.9%以上,说明α-actin基因作为编码蛋白是高度保守的。系统发育分析表明,绿海龟α-actin基因与两栖类亲缘关系较近,而与鱼类亲缘关系较远。本研究丰富了actin基因的资料库,为进一步研究相关基因的表达及功能奠定了基础。     

含铁肠杆菌素受体调节蛋白VPA0148对副溶血弧菌毒力的影响

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种嗜盐性革兰氏阴性菌, 广泛分布于海洋环境中, 能够引起肠胃炎、伤口感染以及败血症, 是人类重要的病原菌之一。宿主体内被认为是一种低铁环境, 能够激发致细菌的毒力。副溶血弧菌能够分泌弧菌素或利用外源铁载体来获取铁。在低铁条件下, 编码双组份调控系统的基因簇VPA0148-VPA0149转录上调, 使含铁肠杆菌素受体PeuA转录出有活性的蛋白。VPA0148编码产物为一个响应调节因子, 具有一个磷酸基团接收结构域和一个DNA结合结构域。本研究发现, VPA0148的缺失增强了菌株的生物膜形成能力和对斑马鱼的致死能力, 同时能够促进菌株在低铁环境中的生长, 并增强菌株的群集运动。研究结果表明含铁肠杆菌素受体调节蛋白VPA0148对副溶血弧菌致病力具有调控作用, 增进了对铁调节副溶血弧菌毒力机制的认识。     

短沟对虾和斑节对虾酚氧化酶原基因的克隆和序列分析

采用RT-PER原理和长片段扩增技术克隆短沟对虾和斑节对虾酚氧化酶原基因。设计合成特异引物、提取血细胞总RNA，反转录后扩增获得的特异片段回收并克隆到pGEM-TEasyVector系统的T载体上，重组子进行碱基序列测定。结果表明，所克隆的短沟对虾酚氧化酶原基因含起始密码子A1B到终止密码子TGA的2055bp，编码684个氨基酸。斑节对虾酚氧化酶原基因含ATG到TGA的2061bp，编码686个氨基酸。短沟对虾酚氧化酶原推算分子量为78153Da，等电点pI为6．25；斑节对虾则为78581Da，pI为5．83，用DNA分析软件分析显示两种对虾酚氧化酶原基因具有高度的同源性，二者的碱基和推测的氨基酸序列同源性分别为93％和92％；对虾与其他节肢动物酚氧化酶原基因的同源性的高低与种类间亲缘关系相关；不同种类间酚氧化酶活性中心重要组成部分的2个铜结合位点、位于铜结合位点内的6个组氨酸以及与铜结合位点相邻的氨基酸序列高度保守。     

养殖近江牡蛎致病弧茵的分离与鉴定

从广东省疫区患病近江牡蛎Crassostrea ariakensis消化盲囊及血液中分离纯化出10株细菌，人工注射感染实验发现其中3株细菌注射组死亡率显著高于对照组。3株细菌均为革兰氏阴性，短杆状，能运动。常规生理生化和Biolog细菌鉴定系统测试结果表明，菌株A3G-2与溶藻弧菌Vibrio alginolyticus亲缘关系最近，菌株A2G-5B与解蛋白弧菌V．proteolyticus亲缘关系最近，菌株B1X-1与鲨鱼弧菌V．carchariae亲缘关系最近。为了进一步确定它们的分类学地位，分别测定了3株弧菌的16S rDNA序列，分析相关细菌相应序列的同源性，并构建系统进化树。结果表明，菌株A3G-2与溶藻弧菌亲缘关系最近，菌株A2G-5B与解蛋白弧菌亲缘关系最近，菌株B1X-1与鲨鱼弧菌亲缘关系最近。因此菌株A3G-2、A2G-5B和BIX-1分别被鉴定为溶藻弧菌、解蛋白弧菌和鲨鱼弧菌。组织病理观察发现患病牡蛎主要受损器官是消化盲囊，表现为腺泡管内壁吸收细胞崩解脱落，管腔扩大，进而管壁解体，消化盲囊出现大面积受损。     

对虾白斑综合症病毒基因组同源重复区结合蛋白的筛选

对对虾白斑综合症病毒（WSSV）基因组序列分析发现，基因组3％的区域均匀分布有与昆虫杆状病毒类似的9个同源重复区，很可能具有昆虫杆状病毒同源重复区参与病毒复制起始或转录调控的功能．以WSSV基因组同源重复区中一个包含高度保守结构域的小重复片断DNA（210bp）作为配体，利用WSSV基因组噬菌体展示库，经过5轮淘选出一个可与DNA特异结合的重组噬菌体克隆，包含的外源DNA片断长度为306bp．通过与WSSV基因组序列对比，发现该序列为WSSV的ORFs中wsv 021的5’端部分．推测wsv 021是一个可能与病毒复制或调控相关的重要功能基因．     

泥蚶(Tegillarca granosa) cDNA 文库的构建及铁结合蛋白基因(Ferritin)序列分析

取正常泥蚶肌肉组织获得总RNA，纯化mRNA后，利用含SfiⅠ酶切位点的CDSⅢ引物逆转录合成cDNA第一链，通过LD—PCR合成cDNA双链，经胶回收除去短片段，与pDNR—LIB载体进行连接，电转化到大肠杆菌DH10B中，构建形成原始文库，进行滴度测试和重组率鉴定。结果表明原始文库的滴度为3．17×10^5cfu／ml，重组率为86．3％，插入片段多在500--2500bp间。随机挑选458个克隆测序，经分析获得94种已知基因及87种未知基因。其中包括铁结合蛋白（Ferritin）的全长cDNA序列。该基因序列全长895bp，5’-端非编码区为163bp，3’-非编码区为213bp，开放阅读框为519bp，编码172个氨基酸。推测其蛋白分子量和等电点分别为20kDa和4．89。氨基酸序列与皱纹盘鲍、太平洋牡蛎、血红扇头蜱、文昌鱼、中华蟾蜍、非洲爪蟾、小家鼠以及人等的同源性有62％-82％。比对结果表明，铁结合蛋白基因在动物进化中高度保守。     

瘤背石磺表皮生长因子基因的克隆、结构及进化分析

首次在瘤背石磺(Onchidium struma)中克隆得到一种新的表皮生长因子(EGF)的cDNA序列全长。EGF基因cDNA的全长为1158bp,命名为Os-egf1,其中开放阅读框长度为846 bp,编码一条包含281个氨基酸残基的多肽链。根据氨基酸序列比对和结构域分析结果发现其含有2个保守的EGF结构域和1个EGF-like结构域,每个结构域中均包含至少6个半胱氨酸残基,且形成CX7 CX4-5 CX10-13CXCX8 C结构,其结构域由C1~C3、C2~C4和C5~C6之间形成的3个二硫键维持,符合表皮生长因子家族及其相关蛋白的特征结构域,但其余氨基酸序列与现有相关基因差异较大,推测可能是一种新的EGF-like基因。利用MEGA6.0软件构建Os-egf1与EGF家族相关蛋白的系统进化树,表明EGF家族蛋白具有一定的物种特异性。     

蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa) Rubisco活化酶基因的克隆与表达分析

采用RACE技术克隆了单细胞绿藻蛋白核小球藻820Rubisco活化酶基因(rca)序列,并用荧光定量PCR方法研究了rca和Rubisco小亚基基因(rbcS)的表达规律。结果获得了1703bp的rcacDNA序列,包括66bp的5’非翻译区、1242bp的开放阅读框和395bp的3’非翻译区。序列比较和分析表明该蛋白核小球藻rca序列与其它绿藻的同源性高达78%—85%;偏好使用以G/C/T结尾的密码子;推测的RCA蛋白等电点和分子量分别为8.44和45.71kDa。荧光定量PCR结果表明随光照时间增加rca与rbcS转录表达逐渐降低;不同盐度处理下rbcS的mRNA量变化不大,而rca在37.5盐度下表达量为25盐度的2.69倍;1.0—3.0mmol/L水杨酸处理rca与rbcS表达均降低。     

cDNA cloning and mRNA expression of the translationally controlled tumor protein (TCTP) gene from Japanese sea perch (Lateolabrax japonicus)

1 Introduction T he translationally controlled tum or protein(TC TP) w as firstdescribed as a grow th-related proteinin m ouse E hrilisch ascites tum or cells and ery-throleukem ia cells (Y enofsky etal., 1983). Subse-quently, TC TP w as founded to be present in m anycells (Sanchez etal., 1997; G ross etal., 1989; C hunget al., 2000; V ercoutter-Edouart et al., 2001) exceptthe hum an kidney cell(Sanchez etal.,1997;G achetetal., 1999). H om ologues of TC TP have been reportedfrom sever…     

眼斑拟石首鱼肌肉生长抑制素基因克隆及组织表达分析

肌肉生长抑制素(MSTN)基因对肌肉生长起负调控作用,在动物育种上具有潜在的应用前景.报道了眼斑拟石首鱼(Sciaenops ocellatus)的MSTN基因的序列结构特征及其组织特异性表达.MSTN基因具有3个外显子和2个内含子,编码376个氨基酸.在内含子Ⅰ和3'-UTR区内,分别发现了(TC)₄CC(TC)₄CT(TC)₄和(AC)₇微卫星序列.推断的眼斑拟石首鱼的MSTN氨基酸序列具很强的保守性,与石鼓鱼、金鲷、条纹石鮨、白鲈、金眼石鮨之间的相似性在90%以上.在结构上,眼斑拟石首鱼的MSTN包含N端信号序列(1~22氨基酸残基),TGF-β前肽域(41~256氨基酸残基),RXXR蛋白水解位点(264~267位的RARR)和TGF-β区域(282~376氨基酸残基).在检测的10种组织中,MSTN只在眼斑拟石首鱼的肌肉、脑和眼组织中表达,其中在肌肉表达最强.     

三种鳜鱼(Siniperca)生长激素基因的克隆及序列比较

采用长片段PCR及T-A克隆技术，从基因组DNA成功克隆翘嘴鳜、大眼鳜和斑鳜含完整阅读框的生长激素（Growth Hormone，GH）基因DNA全序列，翘嘴鳜序列全长5548bp，大眼鳜序列全长5483bp，斑鳜序列全长5789bp，提交GenBank数据库后获得注册号分别为EF205280、EF205281、EF441623。三种鳜鱼GH基因均由六个外显子、五个内含子组成；均在第二内含子中相同位置发现“AG”微卫星重复序列；均在第三内含子末端发现一处剪接位点序列的相邻重复。三种GH基因在第一、二、三内含子处存在碱基长度差异。序列间差异主要表现为邻近序列的重复、DNA片段的缺失或插入及单核苷酸多态性（SNP）。翘嘴鳜与大眼鳜GH基因编码氨基酸序列完全相同，两者与斑鳜序列在第150位有一个氨基酸残基差异。采用MEGA软件对三种鳜鱼GH基因DNA序列及编码氨基酸序列分别构建UPGMA系统发育树，结果表明，在系统发育中，斑鳜可能最先从共有祖先物种中分化出来。     

中国沿海长蛸(Octopus variabilis)自然群体线粒体COI基因遗传多样性研究

对我国沿海5个自然群体长蛸的线粒体细胞色素氧化酶亚基I(COI)部分序列进行了测定和分析,经比对获得658bp核苷酸片段,其中碱基T、C、A和G的平均含量分别为37.02%、18.46%、30.15%和14.35%,AT的含量明显高于GC的含量。5个自然群体的长蛸中共发现18个变异位点,得到15个单倍型,包括4个共享单倍型,其中青岛群体的核苷酸差异数K以及平均核苷酸多样性指数Pi最高,烟台群体最低;群体间,青岛群体在群体间核苷酸差异数K、群体间平均每位点核苷酸替代数Dxy和群体间每位点净核苷酸替代数Da三个指标上都表现出比其它群体之间较高的水平,说明青岛群体具有最为丰富的遗传多样性。MEGA3.1软件计算5个群体间的Kimura2-paramter遗传距离,大连群体和青岛群体之间的遗传距离最远为0.0077,而大连群体与烟台群体之间的遗传距离最低,为0.0029。AMOVA分析表明,五群体间总遗传分化系数Fst=0.17410(P0.05),群体间遗传分化远小于群体内。NJ法和UPGMA法构建的分子进化树,5个地理群体的长蛸聚为两个族群,大连、烟台群体聚为一族群,青岛、连云港和舟山群体聚为另一族群。     

宽体沙鳅(Botia reevesae)热休克蛋白70 基因的克隆及表达分析

为深入分析热休克蛋白响应胁迫的分子机制,实验以宽体沙鳅(Botia reevesae)为研究对象,利用同源克隆和cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE) 技术克隆得到宽体沙鳅热休克蛋白70(BR-HSP70) 的cDNA 全长。结果发现,BR-SP70 cDNA全长为2,371bp,包含1,947 bp的开放阅读框(opening reading frame,ORF),102 bp 5’-非编码区(untranslated region,UTR)和322 bp 3’-UTR等。通过序列同源性比对发现,BR-HSP70 cDNA与团头鲂(Megalobrama amblycephala)和猪(Sus scrofa)的同源性分别为98%及83%,且ORF编码的649个氨基酸中含有HSP70家族的家族信号标签、N-糖基化位点及EEVD等能位点等保守序列。上述结果表明,本研究所获的基因为宽体沙鳅 HSP70基因。实时荧光定量PCR 分析发现,氨氮胁迫和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)侵染均会显著上调宽体沙鳅鳃、肝脏及肾脏HSP70 mRNA的表达,表明HSP70基因在宽体沙鳅应对环境胁迫中发挥了重要的抗应激作用。     

三疣梭子蟹线粒体DNA 16S rRNA和COI基因片段序列的比较研究

本文采用 PCR扩增和序列测定等技术 ,对三疣梭子蟹 (Portunustrituberculatus)线粒体DNA1 6Sr RNA和 COI基因片段进行了初步研究。经 PCR扩增和序列测定 ,分别得到 1 6Sr RNA和 COI2个基因片段的碱基序列 ,其中 1 6Sr RNA基因片段的大小为 566bp,碱基 A,T,G,C的含量分别为 35.1 6% ,34.45% ,1 2 .37%和 1 8.0 2 % ;COI基因片段的大小为 658bp,碱基 A,T,G,C的含量分别为 36.63% ,2 6.44% ,2 0 .52 %和 1 6.41 %。在 2种基因片段中 ,AT含量均明显高于 GC含量 ,这与果蝇、虾类、蟹类等无脊椎动物的 1 6Sr RNA和 COI基因片段研究结果相似。通过对三疣梭子蟹 1 6S r RNA和 COI2个基因片段遗传特征的研究 ,发现其种内变异较低 ,在 3个样本中 1 6Sr RNA基因片段序列完全一样 ,COI基因片段中也只有 2个 T/ C位点转换。另外 ,比较本研究所得序列与 Gen Bank中梭子蟹科 5个属的 1 6Sr RNA基因片段序列后 ,发现其聚类结果与传统分类相一致。