弧菌DS32褐藻胶裂解酶基因vralg1的异源表达和酶学性质研究

对从福建省东山湾沉积物样品中筛选到的菌株Vibrio sp. DS32的褐藻胶裂解酶基因vralg1进行克隆和异源表达,并对其酶学性质进行评估。以DS32基因组为模板,克隆褐藻胶裂解酶基因vralg1,构建了pET-vralg1重组表达载体,并在大肠杆菌中实现了异源表达,对重组酶VRALG1的酶学性质、底物特异性和完全降解产物等进行了测定。结果表明：重组酶VRALG1最适温度为35℃,在5～50℃范围内相对酶活力达到80%以上,最适pH为6.5～7.5,在pH为6.0～9.0范围内保温1 h后相对酶活力在90%以上;重组酶VRALG1最大反应速率为5.919 mmol/(L·min),米氏常数为3.712 mmol/L,最适条件下比活力为5.874 U/mg; K⁺、Cs⁺、Na⁺、咪唑和乙醇对酶活性影响较小,5 mmol/L或50 mg/mL浓度下相对酶活力保持90%以上,EDTA对酶的抑制作用明显,1 mmol/L浓度下可使酶完全失活;重组酶VRALG1对海藻酸钠和聚古罗糖醛酸具有较高的降解活性,TLC分析显示产物主...     

中国明对虾体壁N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

为了探讨对虾N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52,NAGase)的分离纯化及其酶学性质,作者以中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)体壁为材料,通过硫酸铵沉淀分级分离、SephadexG-100柱层析和DEAE-32离子交换柱层析纯化,获得聚丙烯酰胺凝胶电泳纯的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶酶制剂,纯化酶比活力为3938.56U/mg。通过SDS-PAGE凝胶电泳,测得该酶亚基分子量为48.88 kD。酶的最适pH为6.0,最适温度为45℃;该酶在pH 6.0~9.0区域较稳定,温度稳定性范围是20~35℃,45℃下处理1 h酶活力丧失65.04%。酶水解对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷的Km为0.229 mmol/L,Vmax为5.00μmol/(L·min)。进一步研究金属离子对酶活力的影响,结果表明:Li+、Na+和Ba2+对酶没有明显影响,Mg2+、Ca2+、Mn2+、Co2+、Fe3+和Al3+对酶均有不同程度的激活作用,Cu2+、Zn2+和Pb2+对酶呈抑制作用,1.0 mmol/L Hg2+对酶呈激活作用,而10 mmol/L Hg2+使酶活力降低42.37%。     

北冰洋海单胞菌β-D-半乳糖苷酶的异源表达及酶学特性研究

初筛表明,一株分离自北极加拿大海盆海冰心芯样品的海单胞菌(Marinomonas sp.BSi20584)具有较高的β-D-半乳糖苷酶活性,为了研究清楚其酶学性质,将经hiTAIL-PCR扩增得到的β-D-半乳糖苷酶基因(galt)与pET-28a(+)原核表达载体结合,转入大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导后对重组β-D-半乳糖苷酶(GALT)的表达条件进行了优化,采用金属螯合亲和层析技术制备纯酶,并对重组GALT的酶学性质进行了研究。结果显示,重组酶的最适诱导温度为20℃,在IPTG浓度为0.07mmol/L时诱导22h后,酶活和产酶量达到最大值。GALT单体分子量约为6.6×104 g/mol,天然酶为同源三聚体。GALT最适作用温度为35℃,其热稳定性较好,在60℃处理5h后,仍可保持50%以上的相对活性。GALT的最适作用pH为9.0,在pH为6.0~11.0范围内比较稳定。GALT的最适NaCl浓度为0.5mol/L,对盐度具有较高的耐受性。Mg2+、K+、DTT和EDTA对酶活不具有显著影响,而Mn2+、Fe2+对酶活有促进作用,Zn2+和L-谷胱甘肽对酶活有抑制作用。GALT对Galβ1-4GlcNAc具有水解作用,而对Galβ1-3GalNAc和Galβ1-3GlcNAc糖苷键型没有水解能力。本研究实现了海单胞菌属菌株的β-D-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌系统中的高效表达,并系统研究了重组酶的酶学特性,为后续开展该酶的代谢适应性和潜在应用研究提供详细的酶学数据基础。     

海藻工具酶研究Ⅱ.褐藻酸酶的制备、性质及对裙带菜细胞的解离研究

褐藻酸降解菌埃氏交替单胞菌(Alteromonas espejiana)菌株Al01,通过发酵培养制备褐藻酸酶.该酶作用的最适pH为7.0,最适温度为40℃,最适底物浓度为1%～2%;在离子浓度为0.5mmol/dm3时,Mn2+对酶促反应稍有促进作用,Ca2+、Hg2+则有明显的抑制作用.该酶用于裙带菜单细胞和原生质体解离时,以酶液组成为褐藻酸酶1%、纤维素酶1%,45×10-3的NaC1为渗透剂,酶解温度25℃,pH7.0,酶解3-4h效果最好.     

壳聚糖酶的分离纯化及性质研究

以本实验室分离的产壳聚糖酶YJ02菌株出发,制备壳聚糖酶发酵液,经离心、(NH4)2SO4分级盐析、Q-SepharoseFast Flow阴离子交换、Sephacry S-100凝胶过滤分离纯化步骤,SDS-PAGE显示为一条带,壳聚糖酶纯化了28.9倍,收率为47.6%。该酶的性质研究表明,该酶的分子量为66.2KD,最适反应温度为50℃,最适反应pH为6.0;Mn2 对酶活力有明显的促进作用,Cu2 ,Fe3 ,Hg2 对酶活力有抑制作用;小分子有机物EDTA和SDS对酶活力有抑制作用,而IAA和β-巯基乙醇对酶活力稍有促进作用。该壳聚糖酶对高脱乙酰度壳聚糖底物水解作用强,酶解位点可能为NGlc-NGlc,酶最大反应速度Vmax=4.1μmol/min,常数Km为64mmol/L。此壳聚糖酶水解壳聚糖制备的壳寡糖数均分子量为2 400Da。     

α-1,4-葡聚糖裂解酶的动力学性质研究

红藻中的α-1,4-葡聚糖裂解酶是红藻淀粉的降解酶,除了 红藻淀粉外,它还可以作用于多种底物。文中分别以PNPG和可溶性淀粉作底物,以龙须菜的 几个品系作为材料,研究了该酶促反应的动力学方面的性质。以 PNPG作为底物,该酶在60m in内酶促反应速度与保温时间成线性关系;在野生型龙须菜品系中该酶的最适反应温度是50 ℃,在两种突变型品系中是40℃;最适pH范围在4.4～5.5;底物浓度是4mmol/L时达到最大反 应速度;葡萄糖对该酶促反应有明显的抑制作用。以可溶性淀粉作为底物,在反应60 min内 酶反应速度与保温时间成线性关系;最适反应温度为50℃;最适pH范围在5.0～5.8;底物浓 度是8mg/mL时达到最大反应速度;葡萄糖对可溶性淀粉的抑制作用比对PNPG的弱。     

产甲壳素酶菌株的发酵条件、酶的分离纯化及酶学性质研究

利用甲壳素为唯一碳源从土壤中筛选得到1株产甲壳素酶活力较高的菌株HD002,初步鉴定其为Massilia属。确定菌株产甲壳素酶的最适培养基组成为(g/L):(NH4)2SO45,K2HPO40.7,KH2PO40.3,MgSO4.7H2O 1,胶体甲壳素10;最适产酶培养条件为:培养基起始pH值6.0,培养时间192 h,发酵液酶活力达1.314 U/mL。采用70%饱和度硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose F.F阴离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤层析对该甲壳素酶进行纯化,SDS-PAGE证明达到电泳纯。该甲壳素酶的分子量为60.2 kDa,最适反应温度为55℃,最适反应pH值为5.0,Cu2+和Fe3+对酶活力有明显的抑制作用,Ca2+和Na+对酶活力有明显的促进作用。     

超嗜热古菌耐热酸性α-淀粉酶的发酵条件和酶学性质研究

对一株分离自深海热液口的超嗜热古菌(Thermococcus sp.HJ21)菌株进行了α-淀粉酶发酵条件的优化和酶学性质的研究.该菌株发酵9h后到达产酶高峰,产酶温度范围为60-90℃,其最适产酶温度为80℃.产酶pH范围为5.0-9.0,最适产酶pH为7.5.产酶NaCl浓度范围为0.5-4.0%,2.5%为最适宜NaCI浓度.糖原、淀粉、麦芽糖、酵母膏和蛋白胨促进产酶.该菌株产生的α-淀粉酶的分子量为51.4 kDa,酶的最适作用温度为95℃,在100℃仍有60%的酶活力.酶在90℃的半衰期为5 h,在100℃ 2 h仍有40%的残余酶活,酶的热稳定性不依赖Ca2+.酶的最适作用pH为5.0,pH 4.5仍有80%的酶活力,pH在5.5-7.0较稳定(80℃ 4 h).金属离子1 mmol/L的Mg2+、Co2+、Sr2+、Ba2+、K+、Na+对酶有激活作用,Cu2+、Pb2+、Hg2+、zn2+、Al3+对该酶均有抑制作用.     

中国鲎内脏N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

以中国鲎(Tachypleus tridentatus)内脏为材料,分别通过30%和80%饱和度(NH_4)_2SO_4沉淀分级分离、葡聚糖凝胶柱Sephadex G-200层析、以及离子交换柱DEAE-32层析,从而获得N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52,NAGase),经PAGE检定达到电泳纯,酶的比活力为505.21 U/mg。SDS-PAGE显示一谱带,测得该酶蛋白亚基分子量为121.5kDa,等电聚焦电泳法测得酶的等电点pI为6.01。以pNP-β-D-GlcNAc为底物,研究NAGase催化反应的动力学参数。结果表明:中国鲎NAGase的最适pH、最适温度、K_m和V_(max)分别为5.4和55℃、0.421 mmol/L和13.158μmol/L·min~(-1);酶在pH=4.5~7.0范围内较稳定,在20~50℃之间具有较好的热稳定性。酶在276nm波长处有紫外吸收峰,在232.2nm波长的内源荧光激发下,酶内源荧光发射光谱峰在330.9nm波长处。Na~+,K~+和Li~+对NAGase活力没有影响,Ca~(2+)、Ba~(2+)和Co~(2+)对NAGase有不同程度的激活作用,Co~(2+)对NAGase的激活作用较大,5mmol/L Co~(2+)能使NAGase活力提高41.67%;Mg~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)、Mn~(2+)、Fe~(3+)、Al~(3+)、Pb~(2+)、Ag~+、Cd~(2+)和Hg~(2+)等10种金属离子对NAGase活力有不同程度的抑制作用,5mmol/L Cd~(2+)可使酶活力丧失85.60%,而Hg~(2+)对酶的抑制作用最强,0.1mmol/L Hg~(2+)可使酶活力丧失90.10%。EDTA对酶活力没有影响,推断中国鲎NAGase属于非金属酶类。     

牙鲆孵化酶的分离纯化及其部分生物化学性质研究

利用凝胶过滤柱层析和阴离子交换柱层析技术，从牙鲆（Paralichthys olivaceus）胚胎孵化液中分离纯化出了大小约为34．8ku的牙鲆孵化酶。该酶卵膜裂解的最适反应温度为35℃，最适pH为7．0；对底物酪蛋白的米氏常数Km值为1．53mmol／L。该酶对丝氨酸蛋白酶和胰蛋白酶的特异性抑制剂非常敏感，而对其他蛋白酶抑制剂不敏感，表明该酶极可能是一种丝氨酸蛋白酶类型的胰蛋白酶。此外，该酶可浓度依赖性地被EDTA所抑制，被Cu^2＋所强烈抑制，被Ca^2＋和Mg^2＋所激活，对Zn^2＋则不敏感，表明该酶很可能是一种金属蛋白酶。     

复合免疫药物对中国对虾血淋巴氧化酶和抗氧化酶活力的影响

中国对虾口服复合免疫药物“虾康素”后，于第1，3，5，7天分别测定了中国对虾血清中髓性过氧化物酶（MPO），酚氧化酶（PO）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活力，结果表明，血清中MPO，SOD和CAT活力在第1，3，5，7天时均与实验组高于对照组，并且差异极显著。血清中PO活力仅在第1天时，血细胞中PO活力则仅在第1天和7天时，实验组高于对照组，且差异极显著。     

Enzymatic properties of UFE, a novel marine fibrinolytic enzyme

A novel potent protease, Urechis unicinctus fibrinolytic enzyme (UFE), was firstly discovered. The enzymatic properties of UFE were further investigated. As a low molecular mass protein, UFE appeared to be very stable to heat and pH. When temperature was below 50 ℃, the remnant enzyme activity remained almost unchanged, but when temperature was raised to 60 ℃, the remnant enzyme activity began to decrease rapidly. UFE was quite stable in the range of pH value from 3 to 12, especially in slightly alkaline pH value. Mn2 , Cu2 and Fe2 ions were activators of UFE, while Fe3 and Ag ions were inhibitors of UFE. Fe2 ion along with Fe3 ion might regulate UFE activity in vivo. The optimum pH and temperature of UFE were about 8 and 50 ℃, respectively. Other characteristics of this enzyme were also studied. Systematic research results are significant when UFE is applied for medical and industrial purposes.     

海藻酸钠凝胶(C_6H_7NaO_6)_x交联Ca~(2+)包埋风味酶的工艺优化及应用稳定性研究

以海藻酸钠为载体,Ca2+为交联剂,对风味酶进行固定化。以固定化酶活力回收率为指标,在单因素试验基础上,通过响应面分析方法优化了固定化风味酶的工艺,并考察了固定化风味酶使用的稳定性。通过对回归模型进行分析,确定最佳的固定化工艺参数为海藻酸钠浓度2.43%,加酶量(酶液体积/海藻酸钠体积)1:1.76,固定化时间2.89 h,此时固定化酶的活力回收率可达81.88%,考虑到实际操作时对参数精度的控制水平,将固定化酶的优化工艺确定为海藻酸钠浓度2.50%,加酶量(酶液体积/海藻酸钠体积)1:2,固定化时间3.00 h,固定化酶的活力回收率达到80.05%±1.33%。优化工艺下制得的固定化风味酶最适使用温度为60?C,热敏感性降低,稳定性提高;最适p H 8.0,比游离酶向碱偏移了1.0,酸碱适用范围增大;可多次使用,冷藏条件下储藏3周后活力依然保持在80%以上。     

水温对刺参消化酶和免疫酶活力的影响

为研究水温对刺参(Apostichopus japonicus)消化酶及免疫酶活力的影响,本实验将体质量为8.0 g左右的刺参分别于10、14、18、22℃下养殖4周后,对其消化道中蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶活力,以及体腔液中溶菌酶和超氧化物歧化酶活力进行测定。研究结果显示,刺参消化道中蛋白酶含量最高,其酶活在10℃下最高,但随着温度的升高活力逐渐下降,在水温升至18℃以后酶活显著下降;淀粉酶活力在水温升至的18℃时无明显变化,但至22℃时活力显著下降;纤维素酶和脂肪酶活力较小,不同温度下其活力无显著差异。水温对刺参体腔液溶菌酶活性影响显著,在水温为18℃时达到最高值,升至22℃时其活力显著降低;超氧化物歧化酶活性在水温为18℃达到最低,但水温升至22℃其酶活与18℃相比又显著升高。     

石鳖和拟帽贝消化酶解离海藻效果的研究

以藻类为食的石鳖和拟帽贝的消化腺中 含有酶解藻类的消化酶,从这两种海产贝类中提取混合酶能够成为对海藻细胞遗传学研究有 效的工具酶。通过对20种青岛海滨常见藻类酶解效果的比较发现：(1)该酶对各种藻类均有 一定的解离作用,尤其对红藻效果好,对绿藻次之;(2)解离时间相对较短,一般在1h左右 ,解离甘紫菜30min即可有50％的单细胞游离。贝类混合消化酶由于综合多种贝类的食性特 征,具有比单一动物消化酶更广泛的消化作用。     

辽河口芦苇湿地土壤微生物数量及酶活性与石油污染的关系

对辽河口芦苇湿地不同程度柴油污染土壤柴油降解过程中微生物活性的变化进行研究,结果表明不同程度柴油污染会对土壤石油降解菌数量、脱氢酶活性、过氧化氢酶活性和脂肪酶活性造成影响:柴油浓度为1000μg/g时TPHs去除率达90%以上,石油降解菌数量和3种酶活性均显著提高;柴油浓度≥5000μg/g时TPHs去除率都可达70%以上,脱氢酶活性显著提高,石油降解菌数量、过氧化氢酶和脂肪酶活性也都有所提高。其中脱氢酶活性对土壤柴油污染最为敏感,可作为评估湿地土壤柴油污染程度以及去除效果的生物指标。     

氟苯尼考对菲律宾蛤仔抗氧化酶活性的影响

通过室内模拟实验研究了氟苯尼考对菲律宾蛤仔体内超氧化物歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT),过氧化物酶(POD)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性的影响.结果表明,培养7 d后,在氟苯尼考的作用下,菲律宾蛤仔内脏团和肌肉组织的SOD,CAT,POD和GR的活性都发生了变化.低质量比氟苯尼考对SOD,CAT和POD酶活性具有诱导作用,而在高质量比条件下则表现为抑制作用.不同质量比的氟苯尼考对菲律宾蛤仔内脏团和肌肉组织中的GR活性都有明显的抑制作用,且随着氟苯尼考质量比的增加抑制作用加强.     

莫桑比克罗非鱼孵卵期间口腔粘膜变化的研究

用组织学、组织化学和酶技术,对雌性莫桑比克罗非鱼在孵卵前后口腔粘膜的组织结构、抗菌酶的比活力变化进行初步研究。结果表明:在口腔粘膜的上皮中,杯状细胞是一个重要的结构,它随着雌鱼的生理状态的改变而变化。雄鱼、雌鱼和孵卵期的雌鱼口腔粘膜上皮中的杯状细胞数量上的差别显著。孵卵期的雌鱼口腔粘膜类似于哺乳动物的子宫粘膜也是受性激素影响的靶器官。该种鱼的口腔粘膜中存在着两种抗菌酶;蛋白质水解酶和壳多糖酶。孵卵前后,这两种酶的比活力分别提高1.4—2.03倍。说明孵卵时,口腔粘膜为使卵及仔鱼健康的发育,增强了抗菌能力。研究结果证明:抗菌力的增加与口腔粘膜中的杯状细胞的大量增生有着密切的关系。     

海洋硫酸多糖916在2种酶作用下稳定性的研究

利用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)和明胶比浊法研究了海洋硫酸多糖916在溶菌酶和胰蛋白酶作用下的稳定性，分别考察了酶作用下916的重均分子量、分子量分布系数和游离硫酸根含量的变化。结果表明：在所选定的实验条件下，916的重均分子量、分子量分布系数和游离硫酸根含量均未发生显著变化，表明在所选择的实验条件下916对溶菌酶和胰蛋白酶是稳定的。     

产低温纤维素酶海洋嗜冷菌的筛选及研究

从黄海的深海海底泥样中筛选出一株产纤维素酶的海洋细菌，初步鉴定为革兰氏阴性杆菌。该菌既能产生羧甲基纤维素酶，又能降解微晶纤维素，互有淀粉酶活。对该菌生长特征及所产纤维素酶的性质进行了初步研究。此菌最适生长温度为20℃，最高生长温度为40℃，在0℃也能生长，是典型的嗜冷菌。该菌所产纤维素酶最适反应温度为35℃，10℃仍有较高酶活，最适pH值为6．0，属酸性酶。