溶藻弧菌胱硫醚-β-合成酶基因cbs的克隆、生物学信息分析及原核表达

提取溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的总DNA,克隆溶藻弧菌胱硫醚-β-合成酶基因cbs,对其进行生物信息学分析。结果表明,所克隆溶藻弧菌cbs基因的开放阅读框为1 095 bp,编码364个氨基酸。氨基酸序列比对发现,溶藻弧菌的CBS蛋白与其他弧菌的CBS相似性极高,与副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)CBS氨基酸序列相似性达98%;CBS蛋白质的二级结构为典型的"α+β"折叠模式,无跨膜结构及信号肽。构建cbs基因表达载体(p GEX-cbs)以表达重组蛋白,结果显示,cbs基因在大肠杆菌BL21中高效表达,可表达出分子质量约为66.4 ku的融合蛋白。对表达条件进行优化,发现在37℃、IPTG浓度0.6 mmol/L的条件下诱导5 h后,CBS蛋白的表达量较多,该蛋白主要以包涵体形式存在。     

溶藻弧菌acfA基因克隆与生物信息学分析

溶藻弧菌引起海水养殖产业弧菌病的主要病原,附着定植因子基因acfA是溶藻弧菌重要毒力基因之一,其表达产物是溶藻弧菌有效定植在宿主肠道上所必需的蛋白。根据弧菌属细菌acfA基因基因保守区设计引物,采用Touchdown PCR扩增acfA基因部分序列,Inverse PCR和Nested PCR扩增已知序列侧翼序列,成功克隆了溶藻弧菌acfA基因全长。克隆的acfA基因序列全长为743 bp,开放阅读框长度为648 bp组成,共编码215个氨基酸,在5′端上游未发现-35区和-10区序列。演绎的ACFA蛋白N端有18个氨基酸信号肽序列,表明该蛋白是分泌型蛋白;蛋白结构分析表明主要由α螺旋和不规则卷曲构成。BLAST分析表明,该蛋白氨基酸序列与其他弧菌相应蛋白同源性较高,是较保守的外膜蛋白。     

红笛鲷弧菌病血清流行病学研究方法的建立

以红笛鲷Lutjanus sanguineus弧菌病的主要病原菌——溶藻弧菌Vibrio alginolyticus为抗原制备兔抗血清,以辣根过氧化酶标记的羊抗兔血清为酶标二抗,建立了酶联免疫吸附试验检测技术。通过棋盘滴定法测定,得出溶藻弧菌菌悬液的最佳工作浓度为5×108mL-1,兔抗溶藻弧菌血清的最佳稀释度为1∶16000,酶标羊抗兔抗体的最佳稀释度为1∶2000。应用本实验建立的间接双抗体夹心法对红笛鲷进行现场检测,患病红笛鲷特异性抗体的检出率为70%,外观健康红笛鲷的检出率为20%。结果表明,本实验所建立的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测法可以用于红笛鲷弧菌病的血清流行病学研究,而且可以检测出隐性感染状态下的红笛鲷。     

溶藻弧菌免疫胶体金快速检测试纸条的制备

采用溶藻弧菌ATCC17749菌体作为抗原免疫新西兰大白兔,制备兔抗溶藻弧菌多克隆抗体;利用柠檬酸钠还原氯金酸法制备胶体金及胶体金-抗体结合物,并将其喷涂在玻璃纤维膜上冷冻干燥;在硝酸纤维素膜上包被兔抗溶藻弧菌多克隆抗体和羊抗兔IgG分别作为检测线和控制线;将处理后的玻璃纤维素膜、硝酸纤维膜、样品垫及吸水纸组装成双抗夹心试纸条,并对试纸条灵敏度、特异性、稳定性进行评价。结果表明,制备的兔抗溶藻弧菌多克隆抗体的效价可达1∶512 000;胶体金溶胶的最佳制备条件为:加入1.8 mL 10 mg/mL的柠檬酸三钠,500 W微波炉中火加热10 min;试纸条检测线和质控线的抗体最佳包被量分别为8.0 mg/mL和1.0 mg/mL;试纸条检测灵敏度为1×106cfu/mL,特异性试验显示,试纸条与哈氏弧菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、拟态弧菌、美人鱼弧菌、弗氏弧菌、河流弧菌、创伤弧菌等8株菌无交叉反应;稳定性试验表明,试纸在4℃干燥条件下能稳定保存5个月以上。制备的溶藻弧菌多克隆检测试纸条可灵敏、较特异地检测源自病鱼的溶藻弧菌,整个检测过程可在10 min内完成,适用于溶藻弧菌的快速检测。     

溶藻弧菌gr基因缺失株构建及其生物学特性

【目的】研究敲除谷胱甘肽还原酶(GR)基因gr对溶藻弧菌HY9901生物学特性的影响。【方法】通过同源重组技术和Overlap PCR等分子生物学手段构建溶藻弧菌HY9901的gr基因缺失株,通过反转录验证并检测其遗传稳定性,绘制该菌的野生株和缺失株的生长曲线,测定该菌野生株和缺失株的生物膜形成能力、抗生素敏感性、胞外蛋白酶活性和泳动能力等生物学特性。【结果】gr基因的缺失几乎不影响溶藻弧菌的生长趋势,但敲除gr基因后溶藻弧菌对呋喃唑酮、头孢唑林、四环素等敏感性增强,该菌的生物膜形成能力增强显著提高。缺失株△gr的胞外蛋白酶活性和泳动能力均低于野生株。【结论】谷胱甘肽还原酶在溶藻弧菌的毒力、生物膜形成、药物敏感性、泳动等方面有重要作用。     

溶藻弧菌HY9901 vscH基因克隆及生物信息学分析

【目的】克隆溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901 vscH基因,并分析其序列结构。【方法】参照Gen Bank上的溶藻弧菌全基因组序列设计1对特异性引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的Ⅲ型输出蛋白Yop R核心家族蛋白vscH基因全长,用生物信息学手段分析VscH序列,构建VscH系统进化树及亚基三维结构模型。【结果】vscH基因序列全长636 bp,编码211个氨基酸,推导的蛋白分子质量为24.09 ku。经预测,VscH不存在信号肽与跨膜区;含有2个ASN-糖基化位点,14个磷酸化位点,2个N-豆蔻酰化位点,2个内质网靶向序列及2个微体C-末端靶信号位点;有1个主要功能域,T3SS_needle_reg(第71-211氨基酸);α-螺旋占66.35%,无规则卷曲占23.22%,延伸链占5.69%,β-折叠占4.74%;可能的B细胞抗原优势表位,分别是第20~23,25~28,37~40,48~51和109~112区段。溶藻弧菌VscH系统进化树与弧菌(Vibrio)聚为一簇。VscH亚基三维结构模型与鼠疫耶尔森菌毒力因子Yop R蛋白的编码基因ysc H相似。     

波吉卵囊藻对弧菌生长的影响

研究波吉卵囊藻及藻―菌体系对创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)生长的影响,结果显示:无菌波吉卵囊藻对创伤弧菌、副溶血弧菌的生长均有显著促进作用(P<0.05),对溶藻弧菌的生长无显著影响(P>0.05);波吉卵囊藻―沼泽红假单胞菌体系对溶藻弧菌有明显抑制作用(P<0.05);无菌波吉卵囊藻―枯草芽孢杆菌体系对溶藻弧菌的生长有显著促进作用(P<0.05),对创伤弧菌、副溶血弧菌的生长无显著影响(P>0.05);带菌波吉卵囊藻对三株弧菌均有明显抑制作用(P<0.05);带菌波吉卵囊藻共栖细菌对三株弧菌均无明显抑制作用(P>0.05);在无菌波吉卵囊藻中回加带菌藻共栖细菌,分析实验10～18d的数据发现的数据发现藻―菌体系对创伤弧菌、副溶血弧菌的生长有显著影响(P<0.05),藻―菌体系逐渐恢复对三株弧菌的抑制作用。     

溶藻弧菌肽聚糖对凡纳滨对虾虾青素、免疫指标及保护率的影响

从溶藻弧菌中提取肽聚糖,以0.05、0.1、0.15 mg/mL 3种浓度为注射凡纳滨对虾后,测定血淋巴中的血细胞数目、酚氧化酶(PO)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮合成酶(NOS)的活性和虾青素的含量,探讨溶藻弧菌肽聚糖对凡纳滨对虾虾青素含量、免疫指标、免疫保护率的影响。结果表明:注射不同质量浓度的溶藻弧菌肽聚糖都对血清中的血细胞数目、PO、SOD、NOS活性影响显著(p值﹤0.05),对虾青素的含量影响极显著(p值﹤0.01);虾青素的含量与血细胞数目、PO、NOS活性变化趋势无明显的相似性,与SOD活性变化有相似的变化趋势;0.05 mg/mL组的免疫保护率为40%,0.1 mg/mL组为53.33%,0.15 mg/mL组为66.67%。溶藻弧菌肽聚糖可有效地增强凡纳滨对虾非特异免疫力,提高对溶藻弧菌的抗病力,虾青素含量与SOD活性的高低变化趋势相似。     

溶藻弧菌dtd基因的克隆及原核表达条件优化

根据NCBI数据库中已发表的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)全基因组序列合成一对特异性引物,应用聚合酶链式反应(PCR技术)扩增溶藻弧菌HY9001菌株dtd基因,将其定向克隆到原核表达载体pET-32a构建重组表达质粒pET-DTD,并对其进行诱导温度、诱导时间、诱导IPTG浓度等条件的优化,最后探究其纯化时最佳咪唑洗脱浓度。结果表明:DTD蛋白成功表达,且其以包涵体的形式存在,在诱导温度37℃、IPTG浓度0.1 mmol/L条件下诱导5 h表达量最高,纯化最佳咪唑洗脱浓度为150 mmol/L。     

49味中药及其复方与抗生素对溶藻弧菌的体外抑菌作用

【目的】筛选对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)有抑菌作用的中草药及其复方以及抗生素。【方法】采用改良的牛津杯法对诃子、白芍、甘草等49种单味中药进行溶藻弧菌体外抑菌试验,以体外抗菌活性较好的22种药物,按中药配伍规则组成二联、三联复方,采用生药质量浓度分别为60、240 mg/mL的中药进行中药复方体外抑菌试验。用抗生素对溶藻弧菌进行药敏试验。【结果】当单种中药体外抑菌药物质量浓度为240 mg/mL时,诃子、乌梅、醋五味子等对溶藻弧菌抑菌作用明显,为极敏感。在二联中药体外抑菌试验中,当中药质量浓度为60mg/m L时,诃子、乌梅组成复方中药等8种复方对溶藻弧菌协同抑菌作用明显,为极敏感,药物质量浓度在240mg/m L时,诃子与白芍等14种双联中药的协同抑菌作用明显,为极敏感。在三联中药体外抑菌试验中,在药物质量浓度60 mg/mL时,诃子、乌梅、蒲公英等组成24种复方中药按质量比1∶1∶1的抑菌效果极为敏感,药物质量浓度在240mg/m L时,黄芩、诃子、黄芪等22复方中药按质量比1∶1∶1对的抑菌作用明显,为极敏感。溶藻弧菌对恩诺沙星、盐酸多西环素、土霉素及甲氧苄啶/磺胺甲噁唑4种药物高度敏感。【结论】18种单味中药对溶藻弧菌有抑制作用,黄芩、诃子、黄芪等24个三联复方中药药效较强,多个抑菌作用效果良好的三联复方中药可用于鱼病防治研究。     

溶藻弧菌对凡纳滨对虾血清中一氧化氮及氧自由基的影响

对凡纳滨对虾注射浓度为1×105、1×106、1×107mL-1的溶藻弧菌悬液,在注射后4、12、24、48、72和120 h于腹血窦取血,测定其血清中一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量,以及一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物岐化酶(SOD)活力。结果表明,注射溶藻弧菌后,凡纳滨对虾血清中NO含量及NOS活力显著高于对照组,且NOS活力最大值出现时间较NO早;而SOD活力先升高后下降,MDA含量在SOD活力开始下降后逐渐升高,说明一氧化氮系统对凡纳滨对虾感染的溶藻弧菌有清除作用,并能在一定程度上对损伤过程中生成的氧自由基产生作用。     

大亚湾网箱养殖水体弧菌种类组成及变化

研究了海水网箱养殖海域弧菌数量变化、种类组成及其相关因素,探讨弧菌数量的变化与鱼病的关系。结果表明:网箱内水体弧菌数量为390~230 mL-1,平均为20.6×102mL-1,网箱外水体为130~1450 mL-1,平均为530 mL-1,非养殖对照海区为10~390 mL-1,平均为190 mL-1。养殖海区弧菌数量呈现明显的季节性变化,尤其是网箱水体,对照海区只在9月数量较高,其他时间变化不大。平均数量网箱内大于网箱外,网箱外大于对照海区。水体中出现的弧菌种类有河流弧菌Vibrio fluvialis,创伤弧菌Vibrio vulnifgicus,霍乱弧菌Vibrio cholerae,副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus,溶藻弧菌Vibrio alginolyticus,美人鱼弧菌Vibrio damsela,拟态弧菌Vibriomimicus和好利斯弧菌Vibrio hollisae,美人鱼弧菌、溶藻弧菌和霍乱弧菌占有较大优势。弧种数量与海水温度、盐度及营养盐有相关性,但其相关性因不同种和不同点而不同。检测期间,网箱养殖鱼类无明显流行病发生,但弧菌的高峰期明显与报道的鱼病高峰期相吻合。     

Diversity of bacteria isolated from crustacea larvae and their rearing water

1　Introduction　Blacktigershrimp (Penaeusmonodon)isthemajorshrimpspeciesculturedinIndonesia .Itsculturehasbecomemoreintensivebecauseofitshighdemandandeconomicvalue .Infact,shrimpexporthasyieldedthehighestIndonesianincomeinfisherysector .Itwasestimatedthattheproductionofculturedshrimpwas 80 0 0 0metrictonnesin 1995 .Consequently ,theneedforthefryforstockingpondculturesteadilyin creased .Thetotalnumberoffryrequiredwasabout 6millionperyear (FAO ,1995 )and 90 %oftherequiredanimalswereobtained…     

溶藻弧菌双组分调控系统PhoR/PhoB的基因克隆及生物信息学分析

双组分调控系统（Two-component Regulatory System）在致病菌的生长及毒力调控中起重要作用.克隆溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）HY9901 株组氨酸激酶PhoR 和反应调控因子PhoB 的全长基因,并对其进行生物信息学分析.序列分析结果显示,phoR（GenBank 登录号：KJ958404）全长1 299 bp,共编码432 个氨基酸;phoB（GenBank 登录号：KJ863646）全长690 bp,编码229 个氨基酸.构建PhoR/PhoB 的系统进化树,结果显示,溶藻弧菌PhoR/PhoB 与副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、哈氏弧菌（Vibrio harveyi）有较近亲缘关系.利用SWISS-MODEL 软件,对PhoR/PhoB 中两个相对保守的功能域HATPase_c 和REC 进行同源建模,发现HATPase_c具有1 个ATP 结合位点,REC 具有4 个天冬氨酸活性位点.     

溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统注射装置蛋白VscO的原核表达及免疫原性

为探究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)ZJ03株Ⅲ型分泌系统(Type III secretion system,T3SS)注射装置蛋白VscO作为疫苗候选抗原的可能性,根据GeneBank上登陆的溶藻弧菌VscO序列(NO.KJ179947),设计1对带酶切位点的特异性引物,PCR扩增vscO基因,序列分析结果显示,该基因全长462 bp,理论分子质量为18.430ku。将vscO基因定向插入原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-vscO。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,可在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达分子质量约为22 ku的VscO融合蛋白,且该蛋白主要以包涵体形式存在。VscO蛋白表达和纯化的最优条件为:0.1 mmol/L IPTG、37℃条件下诱导4 h,咪唑洗脱浓度为400 mmol/L。用纯化后的融合蛋白免疫SPF级小鼠,获得高效多克隆抗体。Western-blotting结果表明,鼠抗VscO血清既能与重组VscO蛋白发生反应,也能与分离自溶藻弧菌约22 ku的天然蛋白发生反应,提示T3SS注射装置蛋白VscO可能是溶藻弧菌的重要保护性抗原之一。     

Disruption of bacterial balance in the gut of Portunus trituberculatus induced by Vibrio alginolyticus infection

Journal of Oceanology and Limnology - Gut microbiota impacts the health of crustaceans. Vibrio alginolyticus is a main causative pathogen that induces the vibriosis in farmed swimming crabs,...     

溶藻弧菌疫苗对凡纳滨对虾免疫功能的影响

应用溶藻弧菌疫苗饲喂凡纳滨对虾,测定了弧菌疫苗对凡纳滨对虾免疫指标的影响以及 疫苗的免疫保护作用。结果发现,投喂弧菌疫苗后,溶菌活力在12～20d内迅速增强,在20d时 活力达到最高,VF1组高于VF2和VF3组,但VF2和VF3之间差异不显著;凝集效价在投喂后的 第8天开始升高,在14d时达到最高,实验组的凝集活力均高于对照组,但实验组之间无明显的差 异;而超氧化物歧化酶(SOD)活力和溶血活力变化不明显。以每克饲料含疫苗细胞1.0×109、 1.0×108和1.0×107个的浓度投喂,对凡纳滨对虾的免疫保护率分别为66.7%、46.7%和13.3%。 可见弧菌疫苗对凡纳滨对虾的免疫保护率随疫苗浓度的增大而升高。     

光催化降解含乐果废水的研究

以半导体TiO2和自制复合型半导体Fe2O3/TiO2为催化剂对光催化降解乐果废水进行了研究.研究表明复合型光催化剂在可见光照下以及紫外光照下的活性都较好;而半导体TiO2只在紫外光照下才能降解乐果.控制催化剂TiO2的用量能提高对乐果的降解率.     

四川石棉独立碲矿床蚀变岩的地质地球化学研究

四川石棉大水沟独立碲矿床堪称世界首例，其矿体两侧的围岩蚀变较窄，且蚀变带与矿脉及未蚀变岩呈清楚而截然的接触关系。主要围岩蚀变为白云石化、白（绢）云母化、云英岩化及电气石化等。这些蚀变作用分别发生于１７７．７～１６５．１Ｍａ和９１．７１～８０．１９Ｍａ。蚀变作用过程中ＳｉＯ２大量析出，Ａｌ２Ｏ３、ＴｉＯ２、ＣａＯ、ＭｇＯ、Ｋ２Ｏ、Ｈ２Ｏ、ＣＯ２、Ｆｅ２Ｏ３、ＭｎＯ则有不同程度地带入。与此同时，ＲＥＥ在此过程中包集体迁出，Ｔｅ、Ｂｉ、ＡＳ等元素的含量则决定于蚀变作用及其强度，而与原岩无关。