产碱性纤维素酶海洋细菌的筛选、鉴定及酶学性质研究

用CMC平板筛选方法,从青岛近海海域海水中分离出一株产碱性纤维素酶的海洋菌株QM11,经16S rDNA鉴定,该菌株为Cytophaga fucicola.对该菌的生物学特性研究表明,其最适生长温度为27℃,生长温度范围为4～48℃,为耐冷菌;在pH7.0～8.0、含3.0%NaC1的培养基条件下,最适宜菌株生长和产酶;QM11所产碱性纤维素酶最适反应温度为40℃,最适反应pH为9.0,在碱性条件下具有较高的酶活性和较好的稳定性.Mn2+、Fe3+对酶反应具有促进作用,Cu2+、Pb2+对酶反应具有抑制作用.     

海洋弧菌碱性蛋白酶的分离纯化及部分性质研究

采用硫酸铵沉淀、Sephadex- 75 ,Sephadex- 10 0凝胶过滤层析等方法纯化海洋弧菌 (Vibriop acini) X4 B- 7菌株产生的碱性蛋白酶 ,得到电泳纯酶制品 ,并对纯化酶的性质进行了研究。结果显示 :纯酶的分子量为 2 7KD,等电点 p I=8.7,最适反应 p H9.0～ 10 .5 ,最适反应温度 5 0～ 6 0℃。ED-TA对酶活力没有影响 ,高酶浓度可以降低 SDS对酶的抑制作用 ,该酶可用于解聚组蛋白。 DNA琼脂糖凝胶电泳证明 :酶对 DNA酶有降解作用 ,而对 DNA没有降解作用 ,该酶有希望应用于核酸的提取     

YS-80-122海洋低温碱性蛋白酶的性质

碱性蛋白酶是一种最重要的工业用酶,广泛应用于洗涤、食品、皮革和丝绸行业.海洋低温碱性蛋白酶是一种应用我国海洋嗜极微生物黄海黄杆菌(YS-80-122)代谢产物并通过现代生物工程手段开发出的一类新型酶.通过6000转/分离心(4℃),收集(30%-65%)硫酸铵沉淀,透析后等电聚焦制备分离(12W),并经凝胶S-200过滤,获得纯品经SDS- PAGE 聚丙烯酰胺凝胶和C8 HPLC 图谱已达到电泳纯.其分子量为49,320Dal,等电点为8.5.建立酶活-温度-pH 方程与模型( r2＞0.9),可求出其最适温度为30℃,最适pH为9.5,低温(T≤30℃)和低 pH(pH≤8)对保持其稳定性有利.经试验该酶与大多数金属离子和增稠剂及表面活性剂适应性良好.Pb2 、 Ag 、Cu2 对其有抑制作用,EDTA对其有强烈抑制作用.该酶性质与以往发现碱性蛋白酶性质不同,属于一种新型海洋酶.     

舟山海域一株产碱性蛋白酶海洋放线菌的鉴定、选育及发酵条件的初步研究

从舟山海域潮间带海泥筛选到产碱性蛋白酶的海洋放线菌,利用Folin-酚法进行酶活测定,选取酶活最高的菌株进行鉴定,绘制系统进化树。再通过紫外线和DES诱变从而得到高产碱性蛋白酶的海洋放线菌菌株,并进行初步的发酵条件研究。结果表明:分离筛选得到2株菌株,在脱脂奶筛选平板上能产生较大的水解透明圈,通过Folin-酚法进行酶活测定,挑选出酶活较高的菌株A20(初始酶活为104.7U/mL),生理生化试验和16S rDNA试验结果显示该菌株为Streptomyces roseus。对菌株A20进行紫外线和硫酸二乙酯(DES)诱变,最终得到高产碱性蛋白酶的菌株,酶活为227.5U/mL,酶活提高117.3%,传代试验显示该菌株具有较好的遗传稳定性。单因素试验显示最适发酵温度为50°C、pH值为9.0、培养时间为72h。     

南极产低温几丁质酶菌株的筛选及分子鉴定

从南极普里兹湾深海底泥样品中分离得到一批嗜冷细菌,对这些嗜冷细菌进行了产几丁质酶菌株的筛选,对其中一株具有较高产酶活性的菌株AC167所分泌的几丁质酶进行了性质分析,并通过16S rDNA序列分析进行了菌株的分子鉴定。该菌株最适生长温度为10℃,最高生长温度为25℃,是典型的嗜冷菌,经16S rDNA序列比较及系统发育分析鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas)。该菌株只在低于25℃的条件下分泌几丁质酶,酶的最适反应温度为30°C,属于低温酶。     

深海适冷菌SM9913产生的低温蛋白酶

从1855m深的深海泥样中分离纯化得到200多株分泌蛋白酶的适冷菌，其中3株产低温蛋白酶，本文对其中一株Pseudomonas sp.SM9913(P.SM9913)生长的适冷性和它产生的蛋白酶的适低温特性进行了研究。该菌株能够在0℃正常生长，其最适生长温度为15℃，最高生长温度为35℃。为一株适冷菌。该菌株所产蛋白酶的比合成速率在10℃时最高，催化酪蛋白水解的最适温度为35℃，在0℃仍具有3％的酶活力。最适pH为8．0。该蛋白酶的热稳定性很低，在40℃保温10min即丧失85％的活力，40℃时的半衰期为6min，为一典型的低温酶。抑制剂试验表明，该蛋白酶为金属蛋白酶。     

温度和pH值对南美白对虾(Penaeus vannmei)消化酶活性的影响

采用双因子交互的方法研究了不同温度和pH值对南美白对虾淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活性的影响。结果表明 ,南美白对虾肝脏、肠道、胃的淀粉酶最适温度分别为 30℃、35℃、30— 35℃ ,最适pH均为 6 2。肝脏、肠道、胃的蛋白酶最适温度分别为 5 0— 65℃、5 5— 65℃、60℃ ,肝脏蛋白酶最适pH为 8 5— 9 0 ,肠道蛋白酶最适pH为 7 5— 8 5 ,胃蛋白酶最适pH为2 0和 5 5— 6 5。脂肪酶的活力很小 ,肝脏、肠道、胃的脂肪酶最适温度均为 37℃ ,最适pH均为 7 7。同时测得南美白对虾肠道、肝脏、胃组织内的pH分别为 6 7— 7 0、5 9— 6 1、5 1—5 3。在三种消化酶各自最适的温度、pH值下 ,比较其活力大小 ,在肝脏、肠道、胃均为蛋白酶>淀粉酶 >脂肪酶。     

渤海湾浅表海水中产低温蛋白酶适冷菌的筛选

从渤海湾浅表海水中分离到１５０株产蛋白酶的低温菌。对其中５析产蛋白酶活力较高的菌株的生长特征和其所产蛋白酶学性质进行了研究。这５株菌的最知生长温度都在２０～２５℃,最高生长温度都在３５～４０℃,属于典型的适冷菌。这５株菌中,ＳＤＭ９９０８的产酶活力最高,为３２０Ｕ／ｍｌ。这５ 菌所产蛋白酶的最适酶活温度均为３５～４０℃。最适ｐＨ在７．０～９．０范围内,为中性或碱性蛋白酶。这些蛋白酶的热稳定性普遍较     

对深海适冷菌Pseudomonas sp. SM9915分泌不同适冷蛋白酶的研究

从1855m深的海底泥样中分离到一株产适冷蛋白酶的适冷菌Pseudomonas sp.SM9915，经测定发现该菌株的最适生长温度为20℃，最适产酶温度为15℃，粗蛋白酶的最适酶温度为40℃。在此基础上，采用硫酸铵沉淀和分子筛层析方法对P.sp.SM9915分泌的蛋白酶进行了分离纯化。结果表明，P.sp.SM9915至少分泌三种适冷蛋白酶，并且三种蛋白酶的性质有所不同。这三种蛋白的最适pH分别为8．0、9．0、7．0。最适酶海温度分别为45℃、40℃、40℃；其热稳定性也有明显的差别，40℃下保温，酶活的半衰期分别为11min、5min和27min，表明这三种蛋白酶对低温的适应进化是不同步的。     

温度和pH对条石鲷幼鱼消化酶活力的影响

研究了温度和pH对条石鲷Oplegnathus fasciatus幼鱼胃、肠、肝内3种主要消化酶(蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶)活力的影响.结果表明,1)肠和肝的蛋白酶最适温度均为25℃,而胃蛋白酶最适温度为28℃;胃和肝淀粉酶最适温度是22℃,肠淀粉酶的最适温度为19℃;各消化器官的脂肪酶在16℃时活力最高.当温度在16-28℃之间时,条石鲷幼鱼的脂肪酶和蛋白酶活力较高,淀粉酶活力较低.2)胃蛋白酶最适pH为3.2,淀粉酶最适pH是7.6,脂肪酶最适pH为4.2;肠蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶最适pH分别是8.6、6.6和6.6;肝蛋白酶最适pH是7.6,肝淀粉酶和脂肪酶最适pH均为6.6.     

深海沉积物宏基因组文库中产蛋白酶克隆CAPRO2的筛选及酶学性质分析

利用选择性筛选培养基从所构建的深海沉积物宏基因组文库中筛选得到一株产蛋白酶的克隆（CAPR0002）,对其进行了酶学性质分析．结果表明该酶的最适作用温度为65cc,最适作用pH值为9．0．该蛋白酶具有较好的热稳定性,在40cC以下的温度中可长期保持稳定,在50℃中处理6h后仍能保持60％的活力,在60℃下保温30rain后仍能保持约60％的活力．Ca^2＋、Mg^2＋、sr^2＋、co^2＋对该蛋白酶有明显的促进作用,而且ca^2＋的存在可明显提高该蛋白酶的热稳定性,ca^2＋、sr^2＋、c0^2＋这3种离子均在3．0mmol／dm^3。浓度时具有最高的促进作用,当浓度高于3．0mmol／dm’时,这3种离子对酶活力的促进作用减弱．Hg^2＋、Fe^2＋、cu¨对酶有明显的抑制作用．CAPR02蛋白酶在pH值为7。5～9．5时活力较高,pH值为7。5时可保持约80％的活力,pH值为9．5时保持60％的活力,而在pH值高于9．5的条件下酶活力下降较快,pH值为10．0时活力降为约15％,表明CAPR02属于碱性蛋白酶．丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF、E一64和AEBSF对CAPR02蛋白酶均无抑制作用,显示该酶不属于丝氨酸蛋白酶,而EDTA对酶有明显的抑制作用,表明该酶属于金属蛋白酶．     

兼性厌氧海洋细菌Shewanella sp.N3B_R的分离鉴定及产电性能分析研究

本研究的目的是利用聚苯胺修饰双室微生物燃料电池(MFC),从海水养殖废水中分离筛选阳极海洋产电菌,并利用响应面Box-Behnken设计优化各产电因子,提高产电性能。从海水养殖池塘的废水和污泥中分离出一株兼性厌氧海洋菌株,利用16S rRNA基因序列和API 20NE生化分析进行鉴定,采用扫描电镜进行菌株形态的观察。采用循环伏安法(CV)和电化学阻抗谱法(EIS)研究了不同阳极电极在MFC中的性能。采用Box-Behnken设计(BBD)对复合模式进行优化。结果显示:分离到的阳极海洋产电菌株鉴定为希瓦氏菌Shewanella sp.N3B_R,聚苯胺修饰阳极可以减少MFC的电荷转移电阻,输出电压和功率密度比未经修改的碳布电极分别提高了3倍和10倍。BBD结果表明,最适温度为35℃,NaCl和苯胺浓度分别为5 g/L和0.15 mol/L,得到的功率密度最高产率为522.1 mW/m²。     

温度和pH值对南美白对虾(Penaeus vannmei)消化酶活性的影响

采用双因子交互的方法研究了不同温度和pH值对南美白对虾淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活性的影响。结果表明，南美白对虾肝脏、肠道、胃的淀粉酶最适温度分别为30℃、35℃、30—35℃，最适pH均为6．2。肝脏、肠道、胃的蛋白酶最适温度分别为50—65℃、55—65℃、60℃，肝脏蛋白酶最适pH为8．5—9．0，肠道蛋白酶最适pH为7．5—8．5，胃蛋白酶最适pH为2．0和5．5—6．5。脂肪酶的活力很小，肝脏、肠道、胃的脂肪酶最适温度均为37℃ ，最适pH均为7．7。同时测得南美白对虾肠道、肝脏、胃组织内的pH分别为6．7—7．0、5．9—6．1、5．1—5．3。在三种消化酶各自最适的温度、pH值下，比较其活力大小，在肝脏、肠道、胃均为蛋白酶>淀粉酶>脂肪酶。     

温度、pH对缢蛏(Sinonovacula constricta)消化酶活力的影响

本文研究了温度、pH对缢蛏(Sinonovacula constricta(Lamarck))三种主要消化酶(蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶)活力的影响。结果表明：当温度在5～75℃之间时，蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶的最适温度分别为为55℃、45℃和65℃；在不同的pH范围内，蛋白酶的最适PH值为9．2，淀粉酶的最适PH值为6．3和7．7，纤维素酶的最适PH值为5．2。缢蛏的淀粉酶和蛋白酶活力较大，纤维素酶活力极微。     

一株产褐藻酸多糖的海洋假单胞细菌Pseudomonas sp.QDA的筛选和鉴定

根据已获褐藻酸多糖生物合成基因簇中褐藻胶裂解酶基因(αlgL)的序列设计特异性引物，利用PCR技术从海洋微生物中筛选到1株能够分泌胞外多糖的细菌。采用形态学观察和16S rDNA序列分析鉴定该菌株，结果为假单胞属细菌，命名为Pseudomonas sp.QDA；系统发育树显示该菌株与P.putida亲缘关系最近。菌株产生的胞外多糖可被褐藻胶裂解酶(AlgL)降解，并在紫外234nm处检测到特征性吸收，初步证明含有褐藻酸多糖。     

海洋生境芽孢杆菌(Bacillus spp.)的培养条件及产生的胞外抗菌蛋白

测试了4株海洋芽孢杆菌的培养条件对其产生抗菌蛋白的影响;提取的粗蛋白的性质以及对6种病原指示菌的抑菌活性,结果表明,4株海洋芽孢杆菌在2216E,EMB,CM培养液;15～35℃;NaCl浓度0%～5%;pH3～9的条件下均能生长,适宜生长温度20～28℃;NaCl浓度1%～3%;pH5～8.菌株分别培养84～108h抑菌活性最强.(NH₄)₂SO₄沉淀抗菌粗蛋白的最适饱和度为50%～70%.粗蛋白对病原菌尤其对病原真菌具有强烈的抑制作用.粗蛋白性质稳定,对高温和蛋白酶不敏感.     

一株海藻多糖降解菌的分离鉴定及产酶条件优化

从大型褐藻藻体分离获得一株具有高效降解琼胶和褐藻胶能力的革兰氏阴性菌菌株ST-6。16S rDNA序列分析结果表明,该菌株与海绵假单胞菌的相似度达到99%,NJ法构建系统进化树也与海绵假单胞菌归为一类,鉴定为海绵假单胞菌Pseudomonas pachastrellae ST-6。在2216E培养基、30℃培养条件下,海绵假单胞菌ST-6的生长曲线表明,接种10~48 h为菌株的指数生长期,48~72 h为生长稳定期。产酶结果表明,菌株ST-6在指数生长期时菌液的胞外琼胶酶相对酶活力较高,在接种48 h时,菌液的琼胶酶相对酶活力最高为249.15 U/m L。此外,发现菌株ST-6的琼胶酶和褐藻胶酶的分泌类型分别为非诱导型和诱导型。采用单因素分析法对其生长和产酶条件进行分析,结果表明,海绵假单胞菌ST-6最适生长条件为:温度25~35℃,33值5~9;最适产琼胶酶条件为:温度30℃,33值为7,琼胶浓度0.3%。最适产褐藻胶酶条件为:温度35℃,33值为9。在温度30℃、339和褐藻酸钠浓度0.15%的培养条件下,海绵假单胞菌ST-6获得最高胞外褐藻胶酶相对酶活力为135.54 U/m L。     

Bohaisea-9145海洋耶氏酵母碱性脂肪酶基因的克隆、异源表达和重组酶酶学性质

采用基因重组和分子生物学相关技术,对Yarrowia lipolytica Bohaisea-9145海洋低温碱性脂肪酶(Y.lipolytica Bohaisea-9145,LipYp)基因lipYp(1116bp)克隆并在Pichia pastoris中进行了异源真核表达研究。通过MD和MM平板及PCR扩增,筛选和鉴定了重组子。结果表明,阳性重组子经摇瓶发酵54h后上清液酶活力达到1956U/ml。发酵液经两步纯化得到在SDS-PAGE上显示为单一条带的重组脂肪酶。实验同时研究了不同反应温度、pH值对重组LipYp活力和稳定性的影响,结果显示重组LipYp最适反应温度和pH分别为35℃和8.5,在pH7.0-10.5之间以及45℃以下有较好稳定性。另外,重组脂肪酶对中长链对硝基苯基酯类和甘油三酯类(C10-C12)有较强的水解能力。     

夏、冬两季黑鲷消化酶活力的比较

为从黑鲷季节变化规律中循找其饵料配置的科学依据,试验研究了黑鲷胃、肠及肝胰脏中蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等3种主要消化酶在不同季节、不同反应温度下的活力变化.酶学分析结果表明：夏、冬两季3种主要消化酶活力变化趋势基本相似,均为冬季比夏季低,其中蛋白酶的活力冬季比夏季低1个数量级,淀粉酶的活力冬季比夏季低1.2～1.8倍,脂肪酶的活力冬季比夏季低3.3～8.4倍.这可能是由于温度的影响所致.在一定反应温度范围内,黑鲷蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力随反应温度的升高而增大,其最适反应温度分别为50℃,40℃和30℃.     

南海沉积物细菌胞外蛋白酶在家族水平上的多样性

海洋产蛋白酶细菌及其分泌的胞外蛋白酶在降解有机氮以推动海洋氮循环进行方面发挥着重要作用，但目前对这二者多样性的认识非常有限。本研究自南海沉积物中筛选得到90株产蛋白酶细菌，并通过N-端氨基酸序列，分析了其胞外蛋白酶在家族水平上的多样性。16S rRNA基因序列分析的结果表明，筛选的产蛋白酶细菌均属于Gammaproteobacteria纲，且大多数属于Alteromonadales目和Vibrionales目的不同属。对其中14株菌株的14个胞外蛋白酶的N-端氨基酸序列分析表明，所有这些蛋白酶属于金属蛋白酶的M4家族或丝氨酸蛋白酶的S8家族。本研究提供了海洋沉积物产蛋白酶细菌在类群及其胞外蛋白酶在类型上的新细节，这将有助于全面了解微生物酶促降解海洋沉积物有机氮的过程和机理。