红球藻藻株对光强适应及在工程培养中的应用

于2007～2008年在云南楚雄,利用叶绿素连续荧光分析等技术方法,对比研究了3株雨生红球藻藻株(Haematococcus pluvialis)(H_0、H_2、H_3)不同类型细胞对光强适应能力和光化学机制、生长速率和虾青素累积情况,对比研究了红球藻细胞转化过程的光化学特性与能量分配机制。结果表明,3株雨生红球藻游动细胞、绿色不动细胞和红色不动细胞光合作用对光强需求存在明显差异性,其中绿色游动细胞H_0、H_2和H_3光饱和点分别为750、1000、750 μmol/(m~2·s),绿色不动细胞H_0、H_2和H_3光饱和点分别为750、750、500 μmol/(m~2·s),而红色不动细胞H0、H_2和H_3的光饱和点分别为500、750、500 μmol/(m~2·s)。上述数据意味着红球藻光合作用对光强需求以游动阶段细胞最高,其次为绿色不动细胞,而红色不动细胞对光需求最弱;3株红球藻光合作用对光强需求的顺序为H_2H_0H_3。从实际培养效果来看,H_0藻株游动细胞在9月、11月到次年5月生长最好,其中4月、11月比生长速度为藻株H_3的2.19倍和2.17倍,而在6～8月和10月份中,藻株H_2生长比较迅速,但是藻株之间差异性相对较小。针对3株红球藻虾青素累积而言,1～2月、4月、6月、9月、11～12月藻株H0的虾青素含量最高,3月、5月更适宜H_3积累虾青素,其余7～8月和10月H_2藻株积累虾青素更多。综合雨生红球藻细胞生长和虾青素累积二个决定产量的主要因素,作者认为,在秋末、冬、春和夏初等温度和光照相对较低季节,选择藻株H_0规模化培养可获得更好的生产效果,而在光照较强、温度较高和多雨的夏季和秋初季节,应选择藻株H_2培养产量更高。     

褪黑素对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)生理和虾青素积累的影响

本实验初步研究了不同浓度褪黑素(melatonin,MLT)对胁迫条件下雨生红球藻Haematococcus pluvialis LUGU生长、虾青素、相关生理指标及基因表达的影响。结果表明,10μmol/LMLT可显著提高藻细胞中虾青素产量(31.32mg/g),是对照组(13.27mg/g)的2.36倍;碳水化合物和蛋白含量同比提高了1.36、1.37倍。此外,虾青素合成相关基因pds和bkt的表达水平分别提高了5.79和12.16倍。研究表明,MLT可显著促进雨生红球藻中虾青素的积累,为利用微藻生产虾青素提供了一种有效的策略。     

LED灯的光照对雨生红球藻细胞生长及虾青素积累的影响

为提高雨生红球藻的生物量以及细胞内虾青素的积累量,通过不同光源、不同光照强度照射培养藻细胞。研究表明,在总光强为2500lx,红光与白光的强度比例为2:1时,雨生红球藻干重可以达到0.98g/L,比单独使用白光和红光照射下分别提高了36.11%和15.91%。在雨生红球藻转化产虾青素阶段,对比蓝光LED、目光灯以及两者的组合光源照射转化的结果,发现在总光强为7000lx,蓝光与白光的强度比例为3:1时,雨生红球藻中虾青素的积累量为39.79mg/L,明显高于单独使用白光与蓝光转化下的产量。     

雨生红球藻诱变及筛选方法的研究

为获得性状优良的雨生红球藻藻株,满足雨生红球藻商业化生产的需求。本文探索了不同诱变方式以及不同筛选条件对雨生红球藻的影响,得到了γCo~(60)辐射和离子束诱变处理以及将喹禾灵和达草灭作为筛选压对雨生红球藻的致死率曲线。确定离子束照射时间75s和γCo~(60)辐射300Gy为雨生红球藻的适宜诱变条件。喹禾灵30.0μmol/L以及达草灭0.09mmol/L为雨生红球藻的适宜筛选压浓度。对诱变后藻株与对照藻株进行了生物量、干重以及虾青素含量的比较,最终筛选得到三株性状优良的突变株,生物量较未诱变藻株分别提升了16.2%、13.8%和20.4%,虾青素含量与未诱变藻株相比提升了20.7%、15.5%和6.7%。     

不同碳氮浓度对雨生红球藻生长及虾青素累积的影响

研究了不同二氧化碳浓度和硝酸钾浓度对雨生红球藻生长及虾青素累积的影响。结果表明,较高浓度的CO2(600×10-6)能够显著促进雨生红球藻的生长、光合作用的进行和虾青素的累积。红球藻单个细胞内的虾青素含量随着培养液中硝酸钾浓度的降低而增加,绿色游动藻种和绿色不动藻种培养12 d后获得的最大虾青素值分别为10.93 pg/个和12.64 pg/个。连续通气是促进雨生红球藻生长及虾青素累积的一种有效碳源提供方式。     

温度、光照强度和pH对雨生红球藻光合作用和生长速率的影响

采用测定净光合放氧速率的方法研究了温度、光照强度和pH对 4株雨生红球藻光合作用和生长繁殖速率的影响。结果表明 ,温度、光照强度和pH对雨生红球藻的光合作用和生长速率的影响十分显著 ;4株雨生红球藻光合作用的最适温度、光饱和点和pH分别为 :Haematococcuspluvialis 2 6 :1 5℃ ,2 5 0 μmol/(m2 ·s)和pH7 0 ;Haematococcuspluvialis 3 0 :2 0℃ ,2 0 0 μmol/(m2 ·s)和pH8 0 ;Haematococcuspluvialis 3 4 :1 5℃ ,2 0 0 μmol/(m2 ·s)和pH7 0 ;Haematococ cuspluvialisWZ :1 0℃ ,1 40 μmol/(m2 ·s)和pH6 0。雨生红球藻细胞数量的增加与光照时间成正比。初步认为H pluvialis3 0、H pluvialis2 6和H pluvialisWZ是 3个有潜力适合于大规模生产的藻种。     

利用雨生红球藻生产虾青素的研究进展

作为天然虾青素的最佳生物来源，雨生红球藻已成为近年来国内外微藻研究的热点之一．本文综述了国内外雨生红球藻培养及虾青素积累的研究进展，介绍了国外天然虾青素商业生产的现状，并对现存的主要问题和发展方向做出阐述，以期推动国内利用雨生红球藻生产虾青素的商业化进程。     

光照强度和温度对巨藻幼孢子体的生长和生化组成的影响

本文研究了在不同光照强度和温度条件下巨藻(Macrocystis pyrifera)的特定生长率和生化组成,揭示了光照强度和温度对巨藻幼孢子体的生长及生化组成的影响规律。实验共设置4个光照强度处理组(50、100、150和200μmol/(m~2·s))和4个温度处理组(5、10、15和20℃),采用完全交叉分组的方法。结果表明:不同光照强度和温度组合对巨藻幼孢子体生长和生化组成有不同影响,且光照强度和温度对巨藻幼孢子体生长和生化组成具有交互作用。光照强度一定时,随着温度的增加,特定生长率均呈先上升后下降的趋势,各光照强度处理组均在15℃时达到最大值。蛋白质含量呈逐渐上升趋势,各光照强度处理组在20℃时达到最大值;叶绿素a和叶绿素c含量总体呈先上升后下降的变化趋势,除150μmol/(m~2·s)光照强度处理组外,其他光照强度处理组的叶绿素a和叶绿素c均在15℃时达到最大值;碳含量呈先上升后下降的趋势,在10或15℃时达到最高值;氮的含量呈逐渐递减趋势;碳水化合物含量呈先上升后下降趋势,各光照强度组均在15℃时达到最大值。均在温度一定时,随着光照强度的增加,特定生长率均先上升后下降,各温度处理组均在光照强度100μmol/(m~2·s)时达到最大值。蛋白质含量也呈先上升后下降趋势,各温度处理组均在光照强度100μmol/(m~2·s)时达到最大值;叶绿素a和叶绿素c的在不同温度组变化趋势不同;碳含量呈先上升后下降的趋势,各温度处理组均在光照强度150μmol/(m~2·s)时达到最大值;氮含量在光照强度50~150μmol/(m~2·s)呈递减趋势,在200μmol/(m~2·s)时升高,并达到最大值;碳水化合物含量呈先上升后下降趋势,各温度组在光照强度150μmol/(m~2·s)时达到最大值。光照强度、温度及二者的交互作用对巨藻的生长及部分生化组成有显著影响(P0.05),但对巨藻的物质积累没有显著影响(P0.05)。     

玉米素和水杨酸对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)生长及虾青素积累的影响

虾青素是一种具有强抗氧化活性的类胡萝卜素,而雨生红球藻是天然虾青素的主要来源。本文以雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)为材料,研究了植物激素玉米素和水杨酸对雨生红球藻的生长、虾青素含量及相关基因表达的影响。分别添加5种浓度的玉米素或水杨酸,结果发现0.05mg/L玉米素或25mg/L水杨酸处理5d后雨生红球藻虾青素积累最多。该浓度玉米素或水杨酸可显著提高光胁迫下藻细胞密度,最高分别达到3.4×10~5cell/mL和3.0×10~5cell/mL;同时玉米素与水杨酸组中虾青素含量显著上升,分别为1.7%和1.6%,比对照组分别增加29.2%和25.6%。玉米素缓解了高光逆境条件下光合作用基因——Rubisco大亚基(rbcL)及其活化酶(rca)、碳酸酐酶(ca)的下调表达,但对虾青素合成途径β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt)的表达量没有显著影响;而水杨酸则相反,在胁迫后期不能缓解光合作用相关基因的下调表达,但可使bkt基因显著上调,最高可达对照组的2.5倍。本研究首次比较了玉米素和水杨酸对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响,发现玉米素比水杨酸具有更好的促进雨生红球藻中虾青素积累的效果。     

温度对雨生红球藻叶绿素荧光特性及虾青素含量的影响

研究了不同温度(5～35℃)对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)叶绿素荧光特性及虾青素含量的影响.测定的主要参数有:PSII的最大光能转化效率(Fv/Fm)、PSII的潜在活性(Fv/Fo)、PSII的实际光能转化效率(ΦPSⅡ)、光合电子传递效率(ETR)、细胞密度、叶绿素相对含量以及虾青素含量.单因子方差分析结果表明:在整个培养周期中,温度对雨生红球藻各叶绿素荧光参数、叶绿素相对含量、细胞密度以及虾青素含量均有显著影响(P<0.05).多重比较结果表明,在本实验条件下,雨生红球藻的最适生长温度是20℃,其单位体积虾青素含量以20℃处理组为最高,而单个细胞中的虾青素含量则以5℃和30℃为最高.相关性分析结果表明:培养天数为3～10天时,叶绿素相对含量与细胞密度均成显著正相关关系.本文还初步探讨了叶绿素荧光技术在筛选耐高温或耐低温微藻品系中的应用.     

不同培养模式对雨生红球藻细胞绿色生长以及虾青素积累的影响

研究了分批培养、pH反馈补料培养、定量补料培养与培养基完全更换培养4种培养模式对雨生红球藻绿色生长以及虾青素积累的影响。结果表明:当在绿色细胞阶段采用培养基完全更换的培养模式,能够有效的促进雨生红球藻细胞的分裂,同时藻细胞保持了较高活性。其中培养9d后藻细胞数目达到8.60E+05个/mL,游动细胞所占比例达到98.26%,细胞干重为1.12g/L,而且胁迫条件下培养10d后虾青素的产量达到53.21mg/L,明显高于其他培养模式。因此培养基完全更换培养是一种适合雨生红球藻生长与积累虾青素的培养模式。     

稀土元素Ce对雨生红球藻生长及虾青素积累影响的研究

采用反相高效液相色谱分析法（RP-HPLC）研究了稀土元素铈（Ce^3＋）对雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）生长及虾青素积累的影响。结果表明,低质量浓度的Ce^3＋对微藻生长和虾青素积累均具有明显的促进作用,当Ce^3＋的质量浓度为0．1mgm时,对藻生长的促进效果最佳,细胞密度较对照组提高34％;当Ce^3＋的质量浓度为1mg/L时,虾青素质量分数可达到细胞干质量的3．2％,较对照组提高167％。此外,高质量浓度Ce^3＋的对雨生红球藻有抑制作用,当Ce^3＋的质量浓度高于40mgm时,红球藻的生长完全被抑制,虾青素质量分数也明显降低。     

microRNA介导雨生红球藻在高光胁迫下次级细胞壁形成和虾青素积累的分子机制

雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)是天然虾青素的最佳来源,它可以在高光胁迫等不利条件下转变成厚壁细胞并积累大量虾青素。然而,目前从微小RNA (microRNA, miRNA)层面来揭示在高光胁迫下雨生红球藻次级细胞壁形成和虾青素合成的机理研究尚未见报道。对高光处理下三个时间点的雨生红球藻样品进行microRNA测序,共鉴定出342个已知miRNA和283个新miRNA。在这625个miRNA中,其中有206个miRNA的表达量受高光影响,这些差异表达的miRNA的靶基因参与了淀粉与蔗糖代谢、甘露糖与果糖代谢、糖酵解和萜类骨架生物合成等重要代谢通路。结合转录组结果发现,高光胁迫下有6个miRNA调控了3个和次级细胞壁形成相关靶基因的表达,有5个miRNA调控了5个和虾青素生物合成相关靶基因的表达。以上结果揭示了雨生红球藻在高光下miRNA调控次级细胞壁形成和虾青素生物合成的潜在机制,为雨生红球藻虾青素的代谢工程奠定了理论基础。     

雨生红球藻细胞转化、虾青素积累与光照强度的关系及不同品系间的差异性

于2004年利用3个品系的雨生红球藻(H0、H2和H3)和以去除营养物质的藻液为实验对象,探讨了光强对细胞转化和虾青素积累的影响。结果表明,光照强度对红球藻虾青素积累和细胞转化有显著影响,并在品系间存在一定差异性。其中:品系H0在光强≤25000lx时虾青素积累量随光强的增加而增加,光强在20000～35000lx时虾青素积累量处于较高水平,而光照强度>35000lx时,虾青素积累量随光强的升高而下降;H2品系在光强≤25000lx时虾青素积累量随光强的增加而增加,光强在25000lx左右时虾青素积累量较高,当光强≥35000lx时,虾青素积累大幅度下降;H3品系在≤35000lx时虾青素积累量随光强的升高而增加,20000~45000lx为虾青素积累较适宜的光强,高于45000lx时虾青素积累量则明显下降。进一步分析得出,弱光导致红球藻虾青素含量较低是光照强度不足、细胞内虾青素含量少的结果,而强光下虾青素含量下降则是细胞受到损伤、细胞数量减少导致的。对比研究发现:在较低光强下(20000~25000lx)H2单个细胞内虾青素积累量略低于H0,但其积累虾青素总量却最高,这是由于此时H2不动细胞增长速率比其它品系高造成的,不过适宜H2积累虾青素的光照范围最窄,它对高光强的耐受性也最差;而H3在较低光强下虾青素积累总量及单个细胞内的积累速率均最低,但是它的适宜光照范围最宽,即对高光强的耐受性最强,在较大的光强波动范围内都可以保证较高的安全转化量,这就使得它在较高的光强下虽然单个细胞积累虾青素的速率仍然最低,积累总量反而显著高于其它两个品系。     

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)破壁方法对虾青素提取率的影响

采用匀浆法、冻融温差法、超声波法、直接研磨法和低温研磨法等5种破壁方法,研究了雨生红球藻提取虾青素时破壁方法对虾青素提取率的影响。结果表明,对雨生红球藻进行破壁是必要的。其中匀浆法、冻融温差法、超声波法、直接研磨法和低温研磨法等的最佳破壁条件为:匀浆法破壁时间22min,水为介质;冻融温差法破壁温度为-70℃,时间为12h,冻融2次,水为介质;超声功率400W,每次超声时间5s,共超声25min;直接研磨法研磨时间1min;加液氮低温研磨法破壁2次,每次时间0·5min;虾青素的提取率依次为0·76%、0·93%、1·03%、1·51%和3·21%。匀浆法和超声波法破壁由于要使用溶剂或介质,对后续的虾青素提取和分离会有影响,而直接研磨法在破壁过程中产生高温,降低了虾青素的生理活性,所以它们都不是雨生红球藻破壁的最佳方法。加液氮低温研磨法在破壁过程中不添加化学试剂,不产生污染,能最大限度地保留虾青素的生理活性,是所选方法中最好的一种。     

雨生红球藻中IPP异构酶基因表达调控机制的初步研究

单细胞淡水绿藻-雨生红球藻能够在一定条件积累一种次生类胡萝卜素-虾青素,因而在生长后期藻体变为深红色。其中,IPP异构酶在雨生红球藻中的虾青素合成过程中发挥了重要作用。在本研究中,我们首次通过基因组上游步移克隆到了雨生红球藻中IPP异构酶基因的两个不同5’上游侧翼序列,大小分别是1．8kb和2．5kb。利用生物信息学方法分别对这两个不同5’上游侧翼序列进行了序列分析,结果发现,二者具有某些相同的顺式作用元件,如可能的脱落酸反应元件（ABRE）、干燥或低温反应元件（DRE／C-repeat）、几种光反应元件（G-box,GAG-motif,I-boxand ATC-motif）、热激反应元件（HSE）、机械伤害反应元件（WUN-motif）、水杨酸反应元件（TCA-element）、生长素反应元件（TGA-element）、茉莉酸甲酯反应元件（TGACG-element）、缺氧特异反应中的增强子类似元件（GC-motif）和反式作用因子MYB蛋白的结合位点（MBS and MRE）,但是二者并不具有典型的TATA框和CCAAT框。上述研究预示了雨生红球藻虾青素合成中IPP异构酶基因转录调控方式的多样化。     

雨生红球藻紫外诱变及抗铵品系筛选

经紫外诱变,筛选出在碳酸氢铵浓度为400 mg/L条件下可以生存的突变株。通过培养基中氮、磷、铁、温度、光照及pH值对雨生红球藻诱变株生长的影响进行比较,对以上3种营养盐及3种环境因子分别进行三因素三水平正交实验,以优化培养条件。进而对雨生红球藻野生型及诱变株的生长状况及色素含量进行比较。实验结果表明,雨生红球藻抗铵品系在培养基中NaNO30.1 g/L,KH2PO40.01 g/L,FeCl3.6H2O 1.0 mg/L,在pH值为8.0,光照强度100μmol.m-2.s-1,温度为18℃的培养条件下,雨生红球藻的生物量得到有效提高。     

雨生红球藻和虾青素研究述评

虾青系作为食品和饲料色素添加剂有着广阔的应用前景,单细胞绿藻雨生红球藻在特定条件下可双大量积累虾青素,有可能成为该色素的良好天然资源,受到微藻学界的重视。但目前雨生红球藻培养还处于实验室阶段,大规模生产尚存在许多问题有待解决,我国这方面的研究处于起步阶段。为此通过微机查阅１９８１￣１９９７年的国内外发表的有关文献,结合我们的实验结果,从该藻的基础生物学特性、虾青素累积的机制、养殖现状进行了综述,并     

利用光生物反应器培养雨生红球藻的研究初探

用光生物反应器与光照培养箱两种培养容器培养雨生红球藻(Haematococcus pluvialis),对雨生红球藻在两种容器培养过程中细胞生长、pH值、溶解氧(DO)及虾青素积累情况进行比较,同时比较不同接种密度对光生物反应器培养效果的影响。实验表明,光生物反应器中藻细胞的调整期较短,接种1 d后即进入指数生长阶段,在胁迫阶段则仅需4 d即达到虾青素含量的峰值;将pH值控制在偏碱性条件下(7.75±0.10)有利于藻细胞更好生长;营养培养阶段DO相对饱和度上升至80%,而在胁迫阶段则迅速降低,最低值小于6%;较高的接种密度(2.3×104个/mL)具有较短的营养培养周期(7 d),且因接种密度变化对胁迫周期长短无明显影响(均为4 d),选用较高的接种密度可望降低工业生产成本。     

藻际可培养细菌对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响

为探究雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)藻际可培养细菌多样性及可培养细菌对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响,本实验采用培养分离法,在乙酸钠兼养条件下,共分离到8株雨生红球藻藻际细菌,通过16S rDNA测序鉴定,并在NCBI网站比较序列发现,编号为DBQ、HS、BTH、DBB、XBL、HB、FH、JH的菌株分别与Pseudomonas sp.、Methylobacterium sp.、Chryseobacterium sp.、Bacillus sp.、Paracoccus sp.、Planctopirus hydrillae、Rhodobacter vinaykumarii、Brevundimonas vesicularis的16S rDNA序列具有最高的相似性。分别将8株细菌与通过抗生素处理获得的纯种雨生红球藻共培养,测定了8株藻际细菌对雨生红球藻细胞密度、藻液pH、叶绿素及虾青素含量的影响。实验发现,HS处理组在绿色阶段培养第9天获得最高细胞密度,为3.65×10~5cells/mL,且显著高于对照组;DBB处理组虽然能够促进藻细胞密度增加,但与对照组并无显著差异;DBQ处理组藻细胞密度显著低于对照组及其他处理组。第1～7天,藻液叶绿素浓度的变化与藻细胞密度变化趋势有一定相似性,绿色阶段后期,叶绿素浓度呈现下降趋势,也说明藻细胞内部叶绿素向其他色素转变,同时标志着绿色阶段的结束。绿色阶段培养过程中,藻液pH变化幅度较大,由初始值7.0左右上升到9.30左右,但是培养后期处理组与对照组藻液pH并无显著差异。在测定藻液虾青素含量时,仅HS处理组虾青素含量略高于对照组,但并无显著差异;通过计算单个藻细胞虾青素含量发现DBQ处理组单个藻细胞虾青素含量显著高于对照组。