乌鳢(Channa argus)胃蛋白酶原基因克隆及其生物信息学分析

采用RT-PCR和3′RACE技术,首次从乌鳢胃组织中克隆了一种胃蛋白酶原基因。测序结果表明,该基因开放阅读框全长1086bp编码361个氨基酸,递交GeneBank数据库,获得登录号为GQ303143。系统进化关系分析表明,该乌鳢胃蛋白酶原氨基酸序列与鳜鱼类的胃蛋白酶原A2亲缘关系最近,从而推测本研究克隆的乌鳢胃蛋白酶原属于胃蛋白酶原A2类。采用生物信息学的方法和工具预测了该乌鳢胃蛋白酶原的理化参数及其高级结构,结果表明,该乌鳢胃蛋白酶原的相对分子量为38.8kDa,理论等电点为4.56。采用同源建模法建立了乌鳢胃蛋白酶原的三维结构模型,预测了其活性位点及6个必需半胱氨酸残基的位置。该研究结果为进一步研究乌鳢胃蛋白酶的结构和功能关系奠定了基础。     

大黄鱼肌肉生长抑制素基因外显子Ⅱ遗传多态性分析

肌肉生长抑制素是控制动物骨骼肌生长发育的重要细胞因子,采用PCR-SSCP和测序方法分析了150尾大黄鱼样本肌肉生长抑制素基因(myostatin)外显子Ⅱ的单核苷酸多态性,结果发现,外显子Ⅱ中有10个多态位点,分别是29、131、206、261、231、243、265、273、297和300位。其中131位点T→A突变引起相应的氨基酸由L→Q,265位点T→C突变引起相应氨基酸由C→R,261位点A→G突变引起相应氨基酸由S→G,231位点的T→C突变引起相应氨基酸由W→S,273位点的C→T突变引起相应的氨基酸由R→W,297位点的A→G突变引起相应氨基酸由I→V,243位点的G→A突变引起相应氨基酸由D→N,300位点的G→A突变引起相应氨基酸由E→K。29位点A→G和206位点C→A均属于同义突变。存在6种基因型,他们的基因频率分别是0.57、0.23、0.10、0.04、0.02、0.04,该基因位点的杂合度为0.33。     

龙须菜果孢子的紫外诱变及优势突变体的筛选

用紫外线辐射处理野生型龙须菜果孢子体放散刚附着的果孢子,并通过耐高温的筛选,初步获得了2株具有耐高温,生长快速等优良性状的四分孢子体突变株,命名为BZT-11和BZT-18,将其与981和野生型藻株进行了比较分析。结果显示,这2株突变体在实验室内和海上的日平均生长速率为均明显高于981和野生型藻株。在热胁迫时间内,BZT-11和BZT-18的丙二醛(MDA)含量均明显低于野生型,超氧化物歧化酶(SOD)活性明显高于野生型;而在整个胁迫过程中2株突变体与981藻株的MDA含量和SOD活性水平差异不显著。经过4h的热激后,藻株BZT-11和BZT-18的hsp70基因表达水平也显著高于野生型。这些结果进一步证明了该2株突变藻体的耐高温优势。本研究提供了耐高温突变体的筛选技术。     

贝类雌激素受体的同源建模与分子对接研究

采用多模板同源建模方法构建了斑马鱼(Danio rerio)、长牡蛎(Crassostrea gigas)和菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)雌激素受体配体结合区(ER-LBD)的三维结构模型,并开展了与苯并芘(B[a]P)、四溴双酚A(TBBPA)和对壬基酚(4-NP)的分子对接研究。采用PROCHECK、ERRAT和Verify3D软件对同源模型质量进行了综合评估。研究表明:三个模型具有良好的高分辨率结构(>95%),且被合理折叠和建构。分子对接模拟发现,在激活构象中上述配体分子位于两种贝类与鱼类ER的活性配体空腔中,配体结合能的稳定性顺序为B[a]P>TBBPA>4-NP。对接分析表明,与配体结合的三个模型配体口袋的氨基酸残基高度保守,其中在活性位点处结合的主要氨基酸残基为斑马鱼Glu321、Arg362,长牡蛎Glu290、Arg331和菲律宾蛤仔Glu242、Arg283。研究结果表明,通过探究氨基酸残基所构成的空腔和配体形成的静电相互作用网络,能够确定内分泌干扰物(EDCs)对ER的优选程度,为EDCs对贝类内分泌干扰效应研究提供了理论依据和技术支撑。     

高产油突变藻株Desmodesmus sp. D90G-19 的光合作用特征

Desmodesmus sp.S-1 藻株经重离子诱变后得到的一株突变体D90G-19, 较其野生型的油脂产率提高了20.6%; 同时对野生型和突变株的光合放氧速率, 色素组成和叶绿素荧光动力学进行了分析。与野生型相比, 突变体D90G-19 的光合作用有如下特点: 1. D90G-19 的光饱和点为500 μmol/(m²·s), 无论是在强光还是在弱光下, D90G-19 的光合作用效率都显著高于其野生型; 2. 突变体D90G-19 对高温的适应性比野生型强; 3.在弱碱性条件下,D90G-19 的光合效率的提升较之野生型更为显著。培养D90G-19 的最佳光照强度应在250～400 μmol/(m²· s)之间, 最适温度在25~30℃, 培养液pH 值则以弱碱性为宜(7相似文献   

对虾白斑综合症病毒VP37基因诱饵重组载体的构建、转化与自激活作用检测

把对虾白斑综合症病毒(White syndrome spot virus,WSSV)黏附蛋白VP37的基因C末端截去102个碱基后设计了一对引物,通过PCR扩增出目的片段。用其构建酵母双杂交诱饵载体,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用和自激活活性。结果获得截短的VP37基因片段,并成功克隆入酵母双杂交系统PGBKT7 DNA-BD载体中,测序结果表明序列完全正确。把重组载体转化酵母菌AH109并检测自激活作用。结果显示表达的融合蛋白没有激活ADE2,HIS3这2个报告基因,但激活了MEL1,该融合蛋白对酵母菌AH109无毒性。可利用其它2种报告基因将其应用于酵母双杂交系统,筛选cDNA文库中与之相互作用的基因。     

斑鳜(Siniperca scherzeri)胃蛋白酶原A、胃质子泵基因的克隆与组织表达分析

利用RACE技术获得了斑鳜胃蛋白酶原A(PGA1、PGA2)、胃质子泵α和β亚基cDNA序列。结果表明,PGA1、PGA2cDNA序列全长分别为1361bp、1348bp,其编码的前肽中均包含信号肽、激活肽和胃蛋白酶3个部分,成熟肽中含有2个天冬氨酸残基和6个半胱氨酸残基。PGA1与PGA2在氨基酸序列组成、理化性质、功能位点、空间结构上存在明显差异,暗示它们可能具有不同的生理功能。PGA1、PGA2的DNA序列均由9个外显子和8个内含子组成。胃质子泵α和β亚基cDNA全长序列分别为3531bp、1742bp,α亚基具有高度保守性,而β亚基具有相对变异性。斑鳜成体组织中PGA1、PGA2和胃质子泵α、β亚基的RT-PCR检测显示,它们均一致在食道和胃中大量表达,推测PGA1、PGA2与胃质子泵间的表达关系可能存在一定的协同性。     

微拟球藻Ⅰ型脂酰辅酶A:二脂酰甘油酰基转移酶编码基因NoDGAT1A的功能分析

从微拟球藻高产油藻株IMET1的cDNA中,克隆出一个I型脂酰辅酶A:二脂酰甘油酰基转移酶的编码基因NoDGAT1A,该基因共编码437个氨基酸,与拟南芥I型DGAT的氨基酸序列相似度为38%,且含有至少9段高疏水区。随后,NoDGAT1A被转化入营养缺陷型酿酒酵母三脂酰甘油合成突变株H1246中进行诱导表达。结果表明,在外加二十碳五烯酸(EPA)时,表达No DGAT1A的H1246能够产生三脂酰甘油(TAG),针对其TAG的分析表明,与酵母DGAT相比,表达NoDGAT1A的H1246产生的TAG中含有更多的EPA,说明NoDGAT1A具有更强的合成含EPA的TAG之能力。此外,16:0(63.82%)和18:0(27.98%)是其TAG中主要的脂肪酸链成分,说明NoDGAT1A合成的TAG侧链仍以长链饱和脂肪酸为主。NoDGAT1A对微拟球藻中TAG的合成具有重要作用,也为以微拟球藻为模式的产油微藻TAG和EPA代谢网络提供参考。     

大黄鱼抗菌肽hepcidin在巴斯德毕赤酵母中的表达及其产物的抑菌活性

Hepcidin是一类具有独特性质的小分子抗菌肽,克隆得到大黄鱼(Pseudosciana crocea)的hepcidin基因(Lyc-Hepc),cDNA序列全长585个核苷酸,编码一个由85个氨基酸组成的蛋白,包含24个氨基酸的信号肽、35个氨基酸的前导肽和26个氨基酸的成熟肽,成熟肽具有8个保守的半胱氨酸.将Lyc-Hepc 183bp的编码前导肽和成熟肽的前体肽(25aa-85aa)基因片段克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中,然后电击转化巴斯德毕赤酵母SMD1168,经高浓度Zeocin筛选获得多个单克隆.挑取4个克隆进行培养,提取酵母基因组进行PCR检测,结果表明目的基因片段已成功整合到酵母菌SMD1168基因组中,获得酵母工程菌株SMD1168/pP1CZα-Lyc-Hepc.SDS-PAGE和WesternBlot分析表明酵母工程菌株在0.5％甲醇诱导培养72h后,Lyc-Hepc在培养上清中得到了分泌型表达.体外抑菌实验表明重组Lyc-Hepc蛋白能够抑制2株水产养殖病害菌嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的生长.研究结果表明大黄鱼hepcidin可能在抗细菌免疫中发挥了作用.     

低温脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达研究

将已有的低温脂肪酶基因克隆至表达载体pPICZα上,并转化毕赤酵母X-33。在低温条件下诱导培养6d后,发酵液中可检测到低温脂肪酶活力。重组酵母发酵液加入二硫苏糖醇后单位酶活力达到32U/mL,与未加入该试剂的原始菌株相比提高4倍以上。对重组脂肪酶的酶学性质研究表明,其最适pH为8.0,最适温度为35℃,50℃温浴30min后,仍有30.04%的活性。以不同碳链长度的4-Nitrophenyl Ester为底物检测其底物特异性,结果显示其较适合作用于短链底物。重组酵母能够在BMMY培养基中胞外分泌表达带有His标签的重组脂肪酶,经镍柱纯化后,SDS-PAGE检测可得到大约35kDa的单一蛋白质条带。     

江蓠属藻胆蛋白的研究──Ⅱ.龙须菜藻胆蛋白光谱特性和荧光动力学研究

本文以野生型和突变型龙须菜为材料,测定了完整藻体的室温吸收光谱、77K低温荧光发射光谱和叶绿素诱导荧光动力学曲线.野生型(Wt)和黄色突变体(Ye100)的室温吸收光谱有435、498、540、566、618、640和680nm7个吸收峰;绿色突变体Gr180和Gr184则只有除540nm以外的6个吸收峰.3种突变体的藻红蛋白含量均比野生型少,两种绿色突变体的藻蓝蛋白含量相对有所增加,别藻蓝蛋白含量变化不明显.77K低温荧光发射发谱(激发光分别为436、540和580nm)的结果表明:在发射峰的波长上,4种材料没有明显的区别,但Wt中PE吸收的光能传递效率比较低.叶绿素诱导荧光动力学曲线显示Wt的光系统Ⅱ活性、光系统Ⅱ原初光能转化效率及光合碳代谢活性都高于突变体.     

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒编码蛋白的相互作用研究

采用Matchmaker酵母双杂交系统,将对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infection hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)编码蛋白NS1、NS2和CP序列分别构建到酵母猎物载体p GADT7和诱饵载体p GBKT7上,分别转化至酵母AH109以检测重组猎物载体和诱饵载体的自激活作用及对宿主的毒性作用,发现无自激活作用和毒性作用,随后将重组猎物载体和诱饵载体两两共转至酵母AH109中,涂布于SD/-Leu/-Trp固体培养基上,再点种至SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal固体培养基以鉴定编码蛋白间的相互作用。表型鉴定结果显示,只有共转化有p GADT7-CP/p GBKT7-CP的酵母重组子能够在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal上生长并显蓝,而其它重组子均不能在其上生长,表明病毒的CP能够自身互作,而其他编码蛋白间无相互作用。为了进一步研究病毒CP自身互作的作用位点,分别从CP的N端和C端截短若干个氨基酸序列,结果发现CP的自身互作是高度敏感的,任何较少氨基酸序列的缺失都将导致其自身互作的丧失。本研究为深入探讨病毒的组装机制和致病机理奠定了理论基础。     

无结构网格二维海洋模式的正压梯度力算法改进

基于一套自主研制的无结构网格二维河口海洋数值模式A2D,在大圆湖理想模型下,通过与解析解进行比较分析,采用不同架构配置,改进设计正压梯度力计算方法。改进后的算法中引入了从算架构的配置,以配合主算架构,得到更佳的稳定性。通过水位场平面分布与单点过程线可以发现,三组试验的算法均获得了较好的精度和比原算法更好的稳定性,其中TSNS配置算法(中心点计算水位、边中点计算流速的主算架构,配合节点计算水位、边中点计算流速的从算架构)由于其主算架构更接近结构网格下的C网格,在守恒性、移动潮滩边界处理等方面具有一定优势和便利性,有利于在实际海洋中的计算。将TSNS配置算法在江浙沿海进行试算,水位验证结果与实测基本符合,与原A2D模式计算水位之间无显著差异。TSNS算法在稳定性方面的改进,有助于提升模式升级为三维后的稳定性,为今后模式成功升级为三维打下基础。     

锯缘青蟹(Scylla serrata)呼肠孤病毒5个结构蛋白互作分析

采用酵母双杂交系统,对青蟹呼肠孤病毒(Scylla serrata reovirus)5个结构蛋白(VP3,VP6,VP9,VP11,VP12)间的双向互作进行了分析。将5个结构蛋白对应的ORF分别亚克隆至诱饵载体p GBKT7和猎物载体p GADT7,成功构建了10个酵母双杂交重组载体。将重组诱饵载体或重组捕获载体转化至酵母菌Y2H Gold中进行自激活检测,结果显示5个结构蛋白均不能激活酵母菌报告基因HIS3的表达,表明5个病毒蛋白均不具有自激活活性。通过酵母双杂交实验,从5个结构蛋白25个可能性互作对中,共筛选出2个双向互作对(VP11VP6,VP11VP12)和3个自身互作对(VP3VP3,VP11VP11,VP12VP12)。本研究是有关Ss RV结构蛋白互作的首次报道。     

繁茂膜海绵中具有促进细胞粘附成团作用蛋白质的分离纯化研究

用凝胶层析和离子交换层析方法从黄海的繁茂膜海绵(Hymeniacidon perleve)中分离得到一种蛋白质D1,相对分子质量为2,3ku,pI为6．6。纯化的蛋白质富含疏水性氨基酸和酸性氨基酸。研究表明蛋白质D1对繁茂膜海绵细胞培养表现出很强的使海绵细胞贴壁且快速粘附成团的作用。凝集实验表明该蛋白对人的A、B、O、AB血,兔和鼠的红细胞没有凝集活性。     

氨基酸对凡纳滨对虾N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力的影响

选用甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)及精氨酸(Arg)等18种氨基酸为效应物,研究它们对凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶催化pNP-NAG水解反应的影响。结果表明,非极性氨基酸及不带电荷的极性氨基酸对NAGase没有明显的抑制作用;带正电荷的碱性氨基酸L-His及Lys有轻微的激活作用,而Arg则先激活后抑制;带负电荷的酸性氨基酸Asp及Glu有明显的抑制作用,其IC50分别为20,28mmol/L。研究Asp,Glu对酶催化pNP-NAG水解反应的抑制作用机理,并测定其抑制常数。研究表明Asp及Glu的抑制作用均表现为可逆效应,抑制类型均为竞争性抑制,其抑制常数KI值分别为9.50mmol/L和11.06mmol/L。     

海洋球石藻病毒(Coccolithovirus)硫氧还蛋白(Trx)在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达及其活性分析

从实验室保存的pBS-Trx重组质粒中克隆球石藻病毒EhV-Trx基因,构建毕赤酵母重组表达载体pPIC9K-EhV-Trx,将重组质粒电转化毕赤酵母GS115,诱导分泌表达并对重组蛋白进行二硫键还原酶活性分析。结果表明,EhV-Trx基因开放阅读框为591bp,编码197个氨基酸;在毕赤酵母GS115中成功诱导表达重组EhV-Trx,经SDS-PAGE分析目的蛋白分子量约为27.8kDa;重组EhV-Trx具有二硫键还原酶的活性,能有效打开胰岛素A、B两条链的二硫键,有望开发成一种新型的硫氧还蛋白脱敏制剂应用于食品安全领域。     

双通道实时数据采集处理系统的设计与实现

本文提出了一种基于 TMS32 0 C31串行接口的双通道实时数据采集处理系统的设计与实现方案 ,该设计以 TMS32 0 C31和 TL C32 0 AD5 0 C为核心器件 ,具有两个独立的 A/D,D/A通道 ,能够实现 32位浮点计算和 16位数据采集与回放。应用该系统进行归一化最小均方误差 (Normal-ized L east Mean Square,NLMS)算法实时自适应噪声抵消实验 ,实验结果表明 ,该系统能够实现实时的自适应噪声抵消 ,可广泛应用于实时语音信号处理等领域。     

产壳聚糖酶菌株选育及培养条件优化

以假单胞菌Y8．0为出发菌株,分别通过亚硝基胍(NTG),Co^60,UV(紫外)诱变,采用透明圈法筛选,获得了产壳聚糖酶较好的突变菌株假单胞菌Y8,其所产酶活力达到3．0U／mL,酶活力提高近6倍,并具有较好的遗传稳定性。3种诱变方法中,UV诱变效果最好。对假单胞菌Y8产壳聚糖酶培养条件进行研究,得到1个比较优化的培养条件为：pH值6．5,温度32℃,壳聚糖3g／L,酵母膏0．3％,培养时间3d。不同金属离子及不同诱导物对酶合成的影响表明：Fe^2 ,Mg^2 激活作用显著。而Zn^2 ,Mn^2 则具有一定的抑制作用,壳聚糖和氨基葡萄糖对壳聚糖酶的产生都有较好的诱导作用。     

常压室温等离子体技术诱变选育鲅鱼抗氧化肽发酵菌株

鲅鱼(Spanish mackerel)加工后的废弃物富含蛋白质,为了提高蛋白质的利用率并减少环境污染,可以采用微生物发酵的方法酶解这部分蛋白质制取抗氧化活性肽。本实验室已经筛选出一株芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Hy-2,以其发酵水产加工废弃物得到了具有较高抗氧化性的产物。为了进一步提高产物的抗氧化性,作者以该株产蛋白酶芽孢杆菌Hy-2为出发菌,采用常压室温等离子体(ARTP)诱变的方法筛选出1株突变菌Hy-23,以鲅鱼加工后的废弃物为原料,接种该突变菌株进行发酵,得到了具有一定抗氧化活性的发酵产物,酶解物总抗氧化活性提高了12.4%。经遗传稳定性测定,该芽孢杆菌突变株在传代8次之后其遗传稳定性仍然良好。