建立白斑综合症病毒在日本对虾体内潜伏性感染的方法研究

在27℃，pH8．0，盐度33条件下，用套式PCR方法和王证点杂交方法对日本对虾(Penaeus japonicus)体内潜伏性感染WSSV的方法进行了研究。对健康日本对虾注射不同稀释倍数的白斑综合症病毒粗提液，死亡率统计显示注射10^4，10^6倍稀释液组的日本对虾死亡率明显低于10，10^2，10^3倍组，结合套式PCR方法和斑点杂交方法进行病毒检测结果发现，仅10，10^2倍稀释液组斑点杂交和一步PCR结果呈阳性；10^3，10^4，10^6倍稀释液组经二步PCR检测为阳性、斑点杂交呈阴性，该结果为建立或界定WSSV在日本对虾体内的潜伏性感染提供了方法学上的依据。     

二温式多重PCR检测鉴别对虾白斑综合征病毒(WSSV)和传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)的研究与应用

建立了一种同时检测对虾白斑综合征病毒（WSSV）、传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）的二温式多重PCR技术。根据基因库中WSSV（AF369029）和IHHNV（NC002190）基因序列，设计了两对分别与WSSV和IHHNV某段保守基因序列互补的引物，用这两对引物对同一样品中的WSSV和IHHNVDNA模板进行多重PCR扩增，结果均同时得到了两条大小与实验设计相符的593bp（WSSV）和356bp（1HHNV）特异性多重PCR扩增条带，而对其他对虾疾病病原的PCR扩增结果均为阴性；敏感性测定结果表明，该多重PCR技术最低能检测到WSSV和IHHNVDNA各100pg。用该多重PCR对400份临床病料进行检测，结果230份检出WSSV，阳性率57．5％；96份检出IHHNV，阳性率24％；56份同时检出WSSV和IHHNV，阳性率14％。18份为阴性，阴性率为4．5％。结果提示了WSSV和IHHNV广泛存在于中国南方的养殖对虾中，作者建立的二温式多重PCR可以用于这两种病毒的临床快速检测和鉴别诊断。     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)感染白斑症病毒(WSSV)后大颗粒血细胞的变化

采用抗凡纳滨对虾大颗粒细胞的单克隆抗体，应用免疫细胞化学方法，分析了凡纳滨对虾人工感染白斑症病毒(WSSV)后血细胞中大颗粒细胞的变化。研究表明，凡纳滨对虾感染WSSV后，大颗粒细胞的细胞质较正常细胞的多；从WSSV感染凡纳滨对虾的第1天至第3天，大颗粒细胞的数量增加幅度较大。同时，大颗粒细胞占血细胞总数的比例也增加较大：第1天为15．2％，第2天为18％，第3天增大到45．9％，而后大颗粒细胞的比例稍有下降，到第8天下降到43．3％，但仍明显高于对照组(健康虾的大颗粒细胞比例为15．2％)。     

白斑症病毒感染与病毒囊膜完整性的关系

对白斑症病毒（white spot syndrome virus,WSSV）感染与病毒囊膜完整性关系的探讨,是深入研究切断WSSV感染途径,为该病的预防提供一条新思路、新方法并积累实验依据的重要环节.本实验利用物理低渗方法即用蒸馏水使WSSV的囊膜破碎,破坏了病毒囊膜完整性,并用此病毒做螯虾体内、外感染实验.结果发现,WSSV的囊膜破碎后仍具有感染性;在此基础上,分别用抗WSSV囊膜蛋白的单克隆抗体（4G9）和抗WSSV核衣壳蛋白单克隆抗体（2A3）进行螯虾体内中和实验,结果显示抗WSSV囊膜蛋白的单抗有中和作用,而抗WSSV核衣壳蛋白的单抗无中和作用;将破碎的囊膜从核衣壳上去掉后,用不同浓度的纯核衣壳重复以上体内感染实验,结果其感染性消失,说明囊膜破碎的WSSV引起的感染是由WSSV上的破碎囊膜介导的病毒侵染所致,而不是核衣壳被直接内吞引起的.这些结果提示,WSSV是否引起靶细胞感染主要与病毒囊膜上与病毒侵染有关的功能蛋白有直接关系,只要这些功能蛋白活性不变并且存在的量足以与靶细胞膜结合,即使WSSV囊膜破碎、结构不完整也能引起感染.     

流式细胞术检测对虾白斑症病毒(WSSV)对克氏原螯虾血细胞的感染

用WSSV粗提液人工感染克氏原螯虾,感染后分别在6,12,18,24 h采血分离血细胞,通过WSSV的混合单抗和FITC标记的羊抗鼠二抗的间接免疫荧光染色,应用流式细胞仪检测病毒对克氏原螯虾血细胞的感染并分析感染强度.结果表明:分离获得的血细胞形态完好,感染后血细胞内的病毒被标记上了绿色荧光;流式检测发现,随感染时间延长,被感染细胞的百分率及平均荧光强度均逐渐升高,反映血细胞的病毒感染程度逐渐加深;PCR检测同时证实人工感染后各采样点血细胞样品均为WSSV阳性.     

白斑综合症病毒(WSSV)的宿主调查

用地高辛 (DIG)标记的WSSVDNA探针斑点杂交与原位杂交技术 ,在中国对虾、斑节对虾、南美白对虾、刀额新对虾、脊尾白虾、天津厚蟹、日本大眼蟹体内检测到了WSSV ,它们是WSSV的天然宿主 ;在经人工感染的哈氏美人虾、短脊鼓虾、克氏原螯虾、肉球近方蟹、滕壶体内检测到了WSSV ;在球形侧腕水母、病虾池的桡足类等浮游生物、卤虫无节幼体以及人工浸泡感染卤虫成体体内没有检测到WSSV。经原位杂交检测 ,虾类的甲壳下上皮、胃上皮、附肢、造血组织、鳃等组织器官均可被WSSV侵染 ,其中甲壳下上皮和鳃对WSSV敏感 ;蟹类的甲壳下上皮和鳃对WSSV敏感 ;在中国对虾、南美白对虾、脊尾白虾、注射感染的克氏原螯虾的精巢中 ,精荚的结缔组织细胞和血细胞呈阳性 ,在中国对虾、脊尾白虾以及注射感染的短脊鼓虾的卵巢中 ,结缔组织细胞和滤泡细胞被WSSV感染。     

白斑综合症杆状病毒(WSBV)PCR检测方法的改进及应用

斑节对虾Penaeusmonodon白斑综合症是由白斑综合症杆状病毒 (WSBV)所致。患有典型白斑综合症的斑节对虾 ,用两种提取病毒模板DNA的方法 ,进行PCR扩增 :一种是用传统的方法 ,即蛋白酶K ,CTAB等消化 ,酚 /氯仿抽提 ,乙醇沉淀得到DNA ;另一种是用改进的煮沸法提取病毒DNA。对比发现后一种方法稳定性及敏感性比前者高 ,重复性好。用后一种方法对病虾的复眼进行检测 ,PCR结果为阳性。应用后一种方法还对病虾的各组织器官及人工感染的虾进行检测 ,发现病虾中除肝胰腺外 ,附肢、肌肉、心脏、鳃、胃、中肠、神经、复眼、表皮结果均为阳性。感染实验中 ,出现阳性结果注射感染比投喂感染早 ,而且肌肉和附肢较敏感。     

不同饵料对斑节对虾(Penaeus monodon)幼虾的生长及对WSSV 敏感性的影响

采用5种不同饵料投喂斑节对虾幼虾，研究各饵料对幼虾的体长、体重及成活率的影响，实验周期为20天；然后用投喂攻毒的方法分别感染WSSV，观察不同饵料对幼虾WSSV敏感性的影响。实验周期为12天。结果表明，投喂卤虫无节幼体组的幼虾，其体长、体重增长明显优于其它各组（P〈0．01），随后依次为贝肉组、鱼肉组、人工配合饲料组、虾片组。不同饵料对幼虾WSSV敏感性的影响也有差异：投喂感染WSSV后，卤虫组和鱼肉组成活率最高，明显高于贝肉组、人工配合饲料组和虾片组（P〈0．01）。PCR检测表明，感染后全部幼虾个体为病毒阳性。     

温度对WSSV感染中国对虾越冬亲虾的影响

在不同温度下,对中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)越冬亲虾进行人工感染白斑综合症病毒(WSSV)实验,利用腹部采血和剪取游泳足进行活体取样.统计感染对虾发病及死亡情况,利用巢式PCR技术检测WSSV,统计实对虾受WSSV感染情况.结果显示,在对虾累计死亡率上游泳足取样的高温组(18～21 ℃)和低温组(9～12 ℃)有显著差异(P=0.041<0.05),高温组明显高于低温组;在对虾受WSSV感染程度上,高温组主要呈严重感染(91.67%),中温组(13～16 ℃)和低温组则主要呈轻度感染,且温度越低受感染程度越轻;在跟踪WSSV感染对虾进程研究上,高温组在48 h检测出WSSV,中温组和低温组则分别在72 h和96 h检测出WSSV,明显滞后于高温组.表明温度对WSSV感染对虾有一定的影响,低温(9～12 ℃)条件下WSSV也能感染对虾且导致死亡,但低温可抑制WSSV的增殖,减缓感染进程,延迟白斑综合症(WSS)的发生.     

PCR检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)中假阴性的探讨

采用PCR、核酸探针斑点杂交、组织切片等方法研究了PCR检测白斑综合征病毒(WSSV)中的假阴性问题。设计了一对引物用于PCR检测WSSV,PCR扩增的产物长度为235bp,检出极限为0.1pg WSSV DNA。结果表明,PCR检测15例攻毒螯虾鳃样品时出现一例阴性,而经10—106倍稀释后的样品却呈现阳性,推断PCR出现了假阴性。核酸探针斑点杂交及组织切片结果表明注射WSSV的螯虾鳃组织确已被严重感染,进一步证实了PCR假阴性。根据PCR的检出极限及模板稀释梯度,推算出该PCR能成功扩增的引物与模板浓度的比例范围约为2.4×105—2.4×1010。     

白斑综合症病毒膜蛋白VP124参与病毒的感染

白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是对虾的最主要病毒病原之一,给对虾养殖造成了巨大的经济损失。WSSV分别与三种该病毒膜蛋白VP39,VP124和VP187的特异性抗血清在体外作用后,再注射到螯虾体内,进行中和试验。结果显示,注射同或未同VP124抗血清作用的WSSV,8 d后螯虾的死亡率分别是100%和60%,WSSV的感染能够被抗VP124抗体中和。进一步利用定量PCR分析上述三种特异性抗血清对病毒感染的影响,结果显示,VP124抗血清可抑制WSSV在螯虾体内的增殖。所有结果表明,VP124在病毒的感染中起作用。     

对虾白斑综合症病毒vp15基因的RNA干扰研究

VP15是对虾白斑综合症病毒(WSSV)的一种核衣壳蛋白,以往的研究表明VP15属DNA结合蛋白,具有潜在的浓缩包装病毒基因组的功能.利用RNAi技术将vp15基因沉默,来研究vp15基因沉默后对WSSV增殖及结构的影响.体外合成了vp15基因的特异双链RNA(vp15-dsRNA)和非特异双链RNA(gfp-dsRNA),分别与WSSV混合共注射淡水原克氏螯虾.在感染后24、36、48 h,每个实验组分别取病虾步足肌肉,样品用Trizol试剂盒提取RNA用于RT-PCR检测、用病毒检测试剂盒提取DNA模板用于荧光定量PCR分析.另外每组随机选取1只虾,取中肠,用于树脂包埋组织超薄切片分析.逆转录PCR分析结果显示vp15-dsRNA能特异性敲除vp15基因转录表达,实时荧光定量PCR分析结果显示vp15-dsRNA干扰vp15基因的表达能有效抑制WSSV病毒粒子的增值.此外,利用树脂包埋组织超薄切片电子显微镜技术观察发现vp15基因被干扰后病毒粒子数量上明显降低并且引起病毒粒子包装异常.通过vp15基因特异dsRNA干扰,有效抑制了WSSV病毒增殖,此外进一步阐明VP15蛋白的功能及其在病毒组装方面的重要作用,对进一步了解病毒组装以及病毒防治具有重要的意义.     

White spot syndrome virus envelope protein VP124 involved in the virus infection

White spot syndrome virus （WSSV） is one of the major shrimp pathogens causing large economic losses to shrimp farming. In an attempt to identify the envelope proteins involved in the virus infection, purified WSSV virions were mixed with three antisera against WSSV envelope proteins （VP39, VP124 and VP187 ）, individually. And then they were injected intramuscularly into crayfish （Procambarus clarkii） to conduct in vivo neutralization assays. The results showed that for groups injected with virions only and groups injected with the mixture of virions and antiserum against VP124, the crayfish mortalities were 100% and 60% on the 8th day postinfection, individually. The virus infection could be delayed or neutralized by antibody against the envelope protein VP124. Quantitative PCR was used to further investigate the influence of three antisera described above on the virus infection. The results showed that the antiserum against VP124 could restrain the propagation of WSSV in crayfish. All of the results suggested that the viral envelope protein VP124 played a role in WSSV infection.     

虾池中桡足类及其休眠卵携带对虾白斑综合症病毒的初步调查研究

探讨对虾白斑综合症(White Spot Syndrome WSS)与虾池中桡足类之间的关系,于2003年5~10月份,在暴发过对虾白斑综合症的池塘中采集桡足类样品共128个,并从冬季底泥样品分离出桡足类休眠卵样品20个,以及此种休眠卵孵化得来的桡足类幼体样品5个。利用PCR斑点杂交法以及巢式PCR法检测样品中对虾白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus WSSV)携带情况。结果表明,5~10月份桡足类样品中均能检测到阳性样品,总的阳性率为56.3%;其中,5月份样品阳性率为37.5%,6,8,9,10月份各取样1次,每次样品中的阳性率均在60%以上。在20例桡足类休眠卵样品中有1例为阳性,阳性率为5%;并且实验室中孵化此种休眠卵得来的桡足类幼体样品中检测到阳性,阳性率为40%。本研究初步表明,桡足类是WSSV的携带者或传播媒介之一,且冬季池塘底泥中携带WSSV的桡足类休眠卵可萌发出带病毒的桡足类。     

核酸探针原位杂交检测白斑综合症病毒的组织特异性

从白斑综合症病毒 (whitespotsyndromevirus ,简称WSSV)部分基因组文库中得到核酸探针 ,采用原位杂交检测方法检测对虾甲壳下表皮、胃、后肠、鳃、触角腺的上皮细胞、淋巴器官的基质细胞、肌细胞、心肌细胞及结缔组织细胞 ,原位杂交结果均为阳性。对虾甲壳下表皮的上皮细胞、胃的上皮细胞对病毒较其它部位敏感 ,感染程度高 ;中肠上皮细胞、肝胰腺上皮细胞、淋巴器官内皮细胞未发现感染病毒 ,原位杂交用于WSSV检测 ,比组织切片HE染色更准确、更敏感。在同一组织的同一部位 ,原位杂交所得到的阳性细胞个数比HE多。探针大小不同 ,敏感性也有变化。短的探针 41 3bp敏感性较高 ,长的探针敏感性降低。     

对虾白斑综合征病毒(WSSV)宿主研究进展

对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)自1992年暴发以来,已在世界范围内传播开来,每年给对虾养殖业造成巨大经济损失,至今仍未得到完全控制。本文根据1995～2005年的有关文献资料,综述了对虾白斑综合征病毒宿主方面的研究进展。     

白斑综合症病毒基因组同源重复区结合蛋白WSSV021的鉴定

利用噬菌体展示技术,发现wssv021是与病毒基因组同源重复区中一个包含高度保守结构域的小重复片断DNA结合的蛋白质的编码基因,可能参与病毒复制或调控.时相转录分析发现,wssv021属于病毒感染的早期基因.将wssv021基因克隆到pQE-30表达载体,在E.coliXL1-Blue中进行融合表达.凝胶阻滞分析显示,体外表达的（His）6-WSSV021蛋白可以和同源重复区中小重复片断DNA特异性相互作用.     

Construction of white spot syndrome virus (WSSV) whole genome phage display library

A rebuilt vector pCANTAB 5 EE was obtained by inserting a 34 bp double-stranded oligonucleotide which contained a EcoRV recognition sequence into pCANTAB 5 E. White spot syndrome virus (WSSV) genome DNA was fragmented by sonication to isolate fragments mainly in the range of 0.8~2.0 kb, then the fragments were blunt-ended with T4 DNA polymerase and cloned into the EcoRV site of pCANTAB 5 EE. The primary recombinant clone of the library was 3.0×105. Colony PCR of random selected recombinants showed that the size of the inserts was 0.12~1.77 kb. After the whole library recombinant phages infected Escherichia coli HB2151 cells, the extracellular and periplasmic extracts were dropped on PVDF membranes to perform dot blot, using polyclonal mouse anti-VP24 serum, anti-WSV026 serum, anti-WSV063 serum, anti-WSV069 serum, anti-WSV112 serum, anti-WSV238 serum, anti-WSV303 serum and anti-VP26 serum as the primary antibody, respectively. The results showed that the display library could express the viral proteins.     

两种围栏养殖模式防白斑综合征病毒(WSSV)效果的比较

2003年在乳山养殖场采用两种围栏养殖模式养殖了凡纳滨对虾,并对其防白斑综合征病毒(WSSV)效果进行了比较。结果表明,凡纳滨对虾在养殖过程中WSSV阳性率有下降趋势,浮游动物WSSV阳性率较低,布围隔的防病毒效果好于网围隔。