东海几种鳗鲡目鱼类DNA条形码研究

本研究采集了分布于中国东海的前肛鳗(Dysomma anguillaris)、短尾蛇鳗(Ophichthus brevicaudatus)、艾氏蛇鳗(Ophichthus evermanni)、海鳗(Muraenesox cinereus)、黑尾吻鳗(Rhynchoconger ectenurus)、微鳍新鳗(Neenchelys parvipectoralis)、大头蚓鳗(Moringua macrocephalus)、梅氏美体鳗(Ariosoma meeki)和星康吉鳗(Conger myriaster)9种鳗鲡目(Anguilliformes)鱼类,采用PCR技术扩增了线粒体COI基因片段序列, 结合GenBank数据库中下载的5种鳗鲡目鱼类同源序列, 分析比较了序列组成和差异, 并以光海鳝(Muraena argus)和细点海鳝(Muraena augusti)为外群, 基于最大似然法构建了鳗鲡目中6科11属14种鱼类的系统发育树, 探讨了该类群鱼类的系统进化关系。结果显示:72条序列共检测到43种单倍型, 4种碱基含量分别为27.4%(T)、28.2%(C)、25.8%(A)、18.6%(G), 平均A+T含量(53.2%)高于G+C含量(46.8%), 表现出明显的碱基组成偏好性。基于K2P(Kimura 2-parameter)模型计算得出不同种间的平均遗传距离为0.218 8, 不同属间的平均遗传距离为0.225 0, 不同科间的平均遗传距离为0.232 7, 分类阶元越高, 遗传距离越大。系统进化树显示蛇鳗科物种都能够形成独立的分支, 并得到有效的区分, 而其他类群存在混杂现象。以上结果表明, 由于鳗鲡目鱼类种类多且分布广,线粒体COI基因只适用于较低分类阶元(如科内属间、属内种间)间的物种鉴定, 该类群鱼类系统发育关系还有待于结合多种DNA条形码进行深入探讨。     

我国裸胸鳝属鱼类新记录种——奥迪萨裸胸鳝(Gymnothorax odishi)形态与线粒体基因组分析

为完善我国裸胸鳝属鱼类物种信息,研究报道了采集于海南省陵水县裸胸鳝属鱼类新记录种——奥迪萨裸胸鳝(Gymnothorax odishi)。该物种仅于2018年在东印度孟加拉湾首次发现, 目前世界其他海域均无记录。针对采集的奥迪萨裸胸鳝进行详细的外部形态特征分析, 并从分子水平对该裸胸鳝进行线粒体全基因组测序。结果显示, 奥迪萨裸胸鳝主要特征为体型粗壮, 体棕褐色, 吻端至鳃孔区域分布橘黄色斑点, 眼睛后缘存在黑色斑块, 鳃孔边缘黑色, 身体无其他条带或斑纹; 上颌齿、中央齿均单行, 下颌齿两行, 椎骨式为4-52-135。线粒体基因组方面, 奥迪萨裸胸鳝线粒体全长为16 580 bp, 由13个蛋白编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和1个非编码控制区组成, 基因组结构特征与其他脊椎动物相似。基于12个蛋白编码基因构建的海鳝科鱼类分子系统进化树上, 奥迪萨裸胸鳝与匀斑裸胸鳝(Gymnothorax reevesii)、淡网纹裸胸鳝(Gymnothorax pseudothyrsoideus)、疏条纹裸胸鳝(Gymnothorax reticularis)及小裸胸鳝(Gymnothorax minor)聚在一起; 基于COI基因构建的裸胸鳝属鱼类分子系统进化树, 奥迪萨裸胸鳝与匀斑裸胸鳝、淡网纹裸胸鳝、肝色裸胸鳝(Gymnothorax hepaticus)及黄纹裸胸鳝(Gymnothorax monochrous)等聚为一支。遗传距离方面, 奥迪萨裸胸鳝与目前世界上其他裸胸鳝的遗传距离范围为0.082~0.263,均大于最小物种鉴定遗传距离0.020,揭示奥迪萨裸胸鳝在形态与分子水平均为区别于其他裸胸鳝的独立物种。研究结果表明我国海域也有奥迪萨裸胸鳝分布, 为新记录种, 为我国裸胸鳝属鱼类的系统分类及物种名录更新提供分类基础。     

波纹唇鱼mtDNA D-loop 序列变异分析

为研究波纹唇鱼(Cheilinus undulatus)线粒体D-loop 序列遗传多样性, 作者采用聚合酶链式反应和克隆技术对海波纹唇鱼群体(n=25)的mtDNA D-loop 序列进行克隆和测序, 获得长度大约为1 400 bp的产物。用ClustalX 软件进行排序比较, 将结果导入MEGA5.0, 结果显示出在这25 尾个体中, 共检测出66 个变异位点, 包括0 个碱基缺失, 4 个碱基插入, 59 转换位点, 2 颠换位点及1 个转换和颠换同时存在的位点。并用MEGA5.0 软件构建该群25 尾个体的NJ 和UPGMA 系统树。由DNASP 软件计算出该波纹唇鱼群体的多态位点数(S)为62, 核苷酸多样性(P_i)为0.00606, 平均核苷酸差异数为6.907。结果表明波纹唇鱼群体的mtDNA-loop 基因个体差异程度不明显。     

基于线粒体COI基因序列的4个海域口虾蛄群体的遗传多样性研究

为比较中国不同海域口虾蛄(Oratosqilla oratoria)群体的遗传特性, 作者对采自皮口、绥中、青岛和广州4 个海域的口虾蛄群体的线粒体COI基因序列进行扩增和测序, 比较并分析了其遗传多样性和系统进化关系。获得585bp 的口虾蛄线粒体COI基因序列, 发现变异位点54 个, 占总位点数的9.2%。COI基因序列A+T 含量(64.8%)显著高于G+T 含量(35.2%), 符合节肢动物线粒体DNA 碱基组成的特点。转换与颠换的平均比值是7.84, 碱基替换未达到饱和。100 个样本的线粒体COI基因序列共定义35 个单倍型, 单倍型多样性(Hd)为0.9162, 平均核苷酸多样性(π)为0.0203。4 个群体均具有高的单倍型多样性和低的核苷酸多样性的特点, 说明4 个海域口虾蛄的遗传多样性均处于中等水平, 但广州海域的遗传多样性水平最高。AMOVA 分析表明, 来自于群体间的遗传差异(84.53%)明显高于来自群体内的差异(15.47%)。遗传分化系数(F_st)表明皮口、绥中、青岛3 个海域间几乎没有发生分化(F_st<0), 而广州海域口虾蛄遗传分化较大。从GenBank 上下载了19 条粤东海域口虾蛄的同源序列与本实验获得序列共同构建NJ 系统发育树, 结果显示皮口、绥中、青岛聚为一支, 广州和粤东(深圳和汕尾)聚为另一支。单倍型系统发育树和单倍型进化网络关系图均显示出广州海域口虾蛄群体较大的遗传分化。     

两种重要经济石斑鱼肠道微生物群落结构及代谢功能的比较分析

为揭示虎龙杂交斑(Epinephelus fuscoguttatus♀×E. lanceolatus♂)和斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)肠道微生物群落的结构及功能差异, 利用16S rDNA高通量测序技术对其肠道微生物群落进行分析。结果表明: (1) 虎龙杂交斑肠道微生物群落以变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)为主, 斜带石斑鱼中以变形菌门、梭杆菌门(Fusobacteria)和厚壁菌门为主。(2) 在属水平, 虎龙杂交斑和斜带石斑鱼肠道中均含有高丰度的弧菌属(Vibrio)。鲸杆菌属(Cetobacterium)、发光杆菌属(Photobacterium)和丙酸菌属(Propionigenium)是斜带石斑鱼肠道中的标志微生物, 而虎龙杂交斑肠道中的标志微生物为棒状杆菌属1 (Corynebacterium 1)、变形杆菌属(Proteus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和类香菌属(Myroides)。(3) 网络分析显示, 变形菌门在两种石斑鱼肠道中均占主导地位。(4) 功能预测表明, 虎龙杂交斑肠道微生物群落中抗坏血酸与糖醛酸代谢、植物-病原体相互作用和胰岛素信号通路显著高于斜带石斑鱼, 斜带石斑鱼肠道微生物群落的功能在万古霉素类抗生素和链霉素生物合成、亚油酸代谢、双酚降解以及类黄酮生物合成的相关途径中显著富集。研究结果有望加深对石斑鱼肠道微生物群落的认识, 为选择合适的石斑鱼养殖品种, 提高石斑鱼养殖产业的经济效益提供科学参考。     

大黄鱼Lcnkl3基因的分子结构、表达特征及多肽片段抗菌活性

作为重要的免疫基因, NK-lysin参与了鱼类非特异性免疫系统对抗病原感染的免疫应答过程。在之前的研究中, 我们已经发现重要经济鱼类大黄鱼(Larimichthys crocea)体内存在2种类型的NK-lysin基因。在本文中我们报道了1种新型大黄鱼NK-lysin基因Lcnkl3, 并对基因序列、表达特征及其多肽片段的抗菌活性进行了分析。Lcnkl3基因的开放阅读框长度为435 bp, 编码144个氨基酸残基, 其多肽序列Lcnkl3中包含Saposin B结构域及6个高度保守的半胱氨酸残基。系统进化分析表明Lcnkl3与大黄鱼Lcnkl2最为相似, 与其他鱼类NK-lysin多肽则差异较大。Lcnkl3基因在未受感染的大黄鱼各组织中具有不同的基础表达量, 表达水平最高的组织为心脏。在病原诱导的免疫应答过程中, Lcnkl3基因在各组织不同感染阶段的表达模式存在差异。源于Lcnkl3成熟肽序列的多肽片段对不同细菌的抑制和杀灭效果差异显著。以上结果表明Lcnkl3属于大黄鱼NK-lysin基因家族, 并参与了大黄鱼对抗病原感染的免疫过程。     

大菱鲆CD55负调控补体激活及其广谱细菌结合能力

CD55蛋白在哺乳动物中是一种补体调控因子,但其在鱼类中的功能未知。本研究探索了大菱鲆(Scophthalmus maximus) CD55(SmCD55)蛋白的功能。结果表明,SmCD55蛋白由344个氨基酸残基构成,含有一个N端信号肽和3个补体调控蛋白(CCP)功能域。SmCD55基因在大菱鲆多种组织中均有表达,其中,在肌肉中表达量最低,在脑组织的表达量最高。通过原核表达获得了重组的SmCD55(rSmCD55)蛋白,发现rSmCD55蛋白能够抑制大菱鲆血清的溶血活性和杀菌活性,表明其负调控补体系统的激活。此外,本研究还发现rSmCD55蛋白可以结合包括重要水产病原菌迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)、鳗弧菌(Vibrio anguilla­rum)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和海豚链球菌(Strep­tococcus iniae)在内的多种细菌,其中与哈维氏弧菌的结合能力最强。以上这些研究结果丰富了鱼类补体系统的理论知识,加深了对鱼类补体激活调控的了解。     

基于低压静电场及高通量测序技术对中华管鞭虾(Solenocera crassicornis)保鲜过程中微生物群落影响分析

中华管鞭虾(Solenocera crassicornis)隶属于十足目、管鞭虾科、管鞭虾属, 主要分布于我国东南沿海。其富含多种必需氨基酸和矿物质, 高蛋白低脂肪, 但易受微生物污染而发生腐败变质, 需引用基于16S rRNA的高通量测序技术准确测定其微生物群落组成成分变化。以中华管鞭虾为试验材料, 采用高通量测序技术对虾肉的微生物群落碱基进行基因测序, 将产生的碱基序列通过OTU聚类、多样性及相关性分析手段研究了贮藏过程中电场处理后影响中华管鞭虾品质的微生物发育信息和群落组成变化规律。分组为新鲜样本(G0), 2 kV、3 kV及对照组贮藏中期(G1、G2、G3), 2 kV、3 kV、对照组贮藏末期(G4、G5、G6), 通过物种韦恩图、Alpha和Beta多样性以及物种组成分析, 研究不同强度电场环境对中华管鞭虾微生物群落组成的影响。结果表明, OTU聚类分析中优势菌群从属水平看为假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)和热杀索丝菌属(Brochothrix)等, 其中假交替单胞菌属能够适应高盐浓度环境, 是中华管鞭虾微生物腐败主要致腐菌。贮藏中期微生物物种多样性顺序为3 kV组>2 kV组>对照组(0 kV), 电场能够有效抑制优势菌的生长; 贮藏末期3组物种结构相近, 此时电场对虾肉菌群结构无明显影响。PCoA主成分分析图中发现, 在坐标系中贮藏中期的G1、G2、G3组距离较为接近, 贮藏末期的G4、G5、G6组距离较为接近, 说明在同一贮藏期间的各组微生物种群结构类似。综上, 贮藏前中期低压静电场能够抑制优势菌的生长, 维持微生物物种间平衡并使其物种多样性较高, 且3kV更佳, 贮藏末期时由于优势菌更适应环境, 热杀索丝菌属和肉食杆菌属占比增加, 电场对物种多样性的影响不大。研究结果可为深入探讨影响中华管鞭虾贮藏保鲜效果的微生物群落组成和基础发育信息提供有效依据。     

渤海西岸多管藻类的形态分类学研究

利用显微观察及生物冷冻切片技术,对采集自河北秦皇岛的多管藻类(Polysiphonia Complex)海藻样品进行形态分类学研究。经鉴定,样品中包括:多管藻属(Polysiphonia)2种:多管藻(Polysiphonia senticulosa Harvey)和丛托多管藻(Polysiphonia morrowii Harvey);新管藻属(Neosiphonia)2种:倾伏新管藻(Neosiphonia decumbens(Segi) Kim et Lee)和球果新管藻(Neosiphonia sphaerocarpa(Børgesen) Kim et Lee),其中丛托多管藻、倾伏新管藻及球果新管藻均为渤海西岸首次记录。本文对样品物种的外部形态及内部结构特征进行了详细描述,并提供了清晰的特征图片。研究结果补充了渤海湾内的藻类资源数据,为多管藻类相关研究提供了分类学参考。     

基于mtDNA 16S rRNA序列的脉红螺(Rapana venosa)与红螺(R.bezoar)的分类学研究

采用线粒体DNA16SrRNA基因序列测定方法,对中国沿海3目8科的14种腹足类的系统演化关系进行了比较分析。结果显示,共测定了102个个体,获得线粒体DNA16SrRNA基因片段507bp的同源碱基序列;用最大简约法检测到保守位点87个,可变位点409个,简约信息位点254个;计算了碱基替换/颠换率的距离(R)和基于碱基替换+颠换率的距离(D),红螺属内的脉红螺和红螺R值为0.9367,大于0.5,属于种间标志值;采用Kimura2-parametermodel构建了邻接法(NJ)、最小进化法(ME)和最大似然法(MP)等3种系统树,脉红螺和红螺各自均为单系群(支持率=92—100),同时表明它们在检测的14种腹足类中属于相当进化种类。分析结果从线粒体基因序列的层次支持脉红螺与红螺属于不同种类的现代分类方法。     

基于线粒体COI和16S rRNA基因研究3个地理群体黑龙江河蓝蛤的遗传多样性

采用通用引物对辽宁盘锦、辽宁大连、山东日照的3个地理群体黑龙江河蓝蛤(Potamocorbula amurensis)COI和16S r RNA序列进行扩增、测序分析,得到30条658bp的COI基因部分序列和27条450 bp的16S r RNA基因部分序列。其中COI和16S r RNA基因部分序列T、C、A、G和A+T的平均含量分别为45.4%和32.0%、13.5%和13.3%、20.7%和29.3%、20.4%和25.3%、66.1%和61.3%,AT含量高于GC含量,这与其他软体动物门动物的COI和16S r RNA的观测结果相近。COI和16S r RNA分别检测到了24个单倍型、43个核苷酸多态位点和9个单倍型、19个核苷酸多态性位点。AMOVA分析表明,3个群体间COI和16S r RNA部分基因总遗传分化系数分别为Fst=0.0090(P0.001)和Fst=0.0674(P0.001),群体内遗传分化远大于群体间、群体内存在较高的遗传分化。用NJ法构建分子进化树,3个地理群体的黑龙江河蓝蛤聚为一个族群,有少数个体和其他群体的个体聚在一起。     

基于16S rRNA 部分序列探讨部分鳚亚目鱼类的分子系统进化关系

通过PCR扩增获得了3科5属6种中国黄渤海海域的鳚亚目(Blennioidei)鱼类的线粒体16S rRNA基因序列片段约669bp碱基,结合来自 GenBank的5种鳚亚目其他科鱼类的相应基因片段,并以眼斑雪冰鱼(Chionodraco rastrospinosus)为外群,生成供系统发育分析的序列矩阵,利用MEGA 4.0软件分析序列的碱基组成、差异百分比、转换/颠换值等,应用最大简约法(MP)和邻接法(NJ)构建系统发育树.结果显示:在鳚亚目鱼类的16S rRNA 片段生成的序列矩阵中发现有碱基的插入缺失现象,共有207 bp变异位点,转换/颠换值为0.8,碱基平均差异为3.36;支持绵鳚(Enchelyopus elongates)归于鳚亚目绵鳚科(Zoarcidae),鳚(Azuma emmnion)归于鳚亚目线鳚科(Stichaeidae);方氏云鳚(Enedrias fangi)和云鳚(Enedrias nebulosus)种间遗传距离只有0.01,亲缘关系最近.     

基于线粒体16S rRNA 基因研究5 个栉江珧野生群体的遗传多样性

采用通用引物对山东长岛、文登、日照、广东湛江和海南三亚等5个地理群体栉江珧(Atrina pectinta)16S rRNA序列进行扩增、测序分析,得到59条441bp的核苷酸序列.其中T、C、A、G和A+T的平均含量分别为29.91%、17.41%、25.74%、26.94%及55.65%, AT含量高于GC含量,共检测到了9个单倍型和26个核苷酸多态位点.群体多样性分析表明,文登群体具有较高的遗传多样性水平.AMOVA 分析表明,五群体间总遗传分化系数Fst =0.5007(P<0.001),群体间遗传分化略大于群体内、群体间存在较高的遗传分化.基于群体间遗传距离构建NJ和UPGMA分子进化树,5个地理群体的栉江珧聚为两个支,长岛、文登、日照群体聚为一支,海南和湛江群体聚为另一支.     

基于16S rDNA基因序列探讨引进物种紫扇贝(Argopecten purpuratus)在海湾扇贝属(Argopecten)中的分类地位

秘鲁紫扇贝(Argopecten purpuratus)于2008年被引进我国,与海湾扇贝(Argopecten irradians irradians)成功杂交。为探讨紫扇贝在海湾扇贝属中的分类地位及与相似种海湾扇贝的进化关系,随机选取紫扇贝和海湾扇贝各10个个体,利用通用引物进行16S rDNA基因片段扩增并双向测序。序列分析结果表明,紫扇贝和海湾扇贝扩增获得基因片段长度均为542bp,碱基组成A+T所占比例分别为紫扇贝54.2%和海湾扇贝55.1%。紫扇贝和海湾扇贝种内分别有6和10个变异位点,种间有41个变异位点,且种内和种间变异均为转换或者颠换,无插入/缺失类型。结合Gen Bank同源序列信息,对海湾扇贝属物种进行遗传距离分析及分子系统树的构建。结果表明:海湾扇贝属7种扇贝[紫扇贝(A.purpuratus)、A.irradians、墨西哥湾扇贝(A.i.concentricus)、A.i.irradians、A.nucleus、A.gibbus和A.ventricosus]在系统树上聚为2支,与紫扇贝亲缘关系最近的是A.ventricosus,且该两种扇贝单独聚为一支。其余5种扇贝中,A.irradians、A.i.concentricus和A.i.irradians最先聚为一支,支持A.i.concentricus和A.i.irradians为A.irradians两个亚种的结论;另外,A.nucleus与以上三者也有很近的亲缘关系。该研究结果为海湾扇贝属物种进化、迁移及其遗传育种研究提供了理论基础。     

10个菲律宾蛤仔野生群体的遗传多样性研究

对我国沿海地区10个菲律宾蛤仔野生群体线粒体16S r RNA和COI基因部分序列进行测序,分别得到了长度为473bp和632bp的片段。结果表明,16S r RNA 193条序列A+T平均含量为66.6%,共检测到21个变异位点,193个个体具有22种单倍型;COI基因183条序列A+T平均含量为64.8%,共检测到126个变异位点,183个个体具有67种单倍型。基于群体间遗传距离利用Mega5.1软件构建10个群体的NJ树,聚类结果表明,大连群体和荣成群体聚为一支,其余8个群体聚为一支。AMOVA分析表明,大连群体和荣成群体间分化不显著,而荣成、大连群体与其余8个群体间的分化达到极显著水平(P0.01),说明我国沿海的菲律宾蛤仔野生群体存在一定的遗传分化。     

5种石斑鱼核糖体DNA ITS1序列及其分子系统进化关系

为了明确分布于中国海域点带石斑鱼(Epinephelus malabaricus)、青石斑鱼(E.awoara)、巨石斑鱼(E.tauvina)、六带石斑鱼(E.sexfasciatus)和宝石石斑鱼(E.areolatus))等石斑鱼属(Epinephelus)鱼类的系统发育关系,作者采用PCR和DNA测序技术,测定了5种石斑鱼属鱼类的核糖体DNA ITS1序列,获得其ITS片段长度分别为537、536、535、528、532 bp。研究结果表明:5种石斑鱼r DNA ITS1序列的碱基组成趋势相似,A+T含量皆低于C+G含量,A+T含量最低为宝石石斑鱼(37.6%),最高为六带石斑鱼(41.5%);基于Kimura-2双参数模型计算得到上述石斑鱼种间遗传距离在0.0000~0.3002。基于MP法、ML法和NJ法构建的3种分子系统树表明,r DNA ITS1序列与形态呈同步进化关系,宝石石斑鱼与其他4种石斑鱼的亲缘关系较远,表明在所研究的物种中最早分化而出,而点带石斑鱼与青石斑鱼的亲缘关系最近,分化的时间最晚。     

长江中下游地区湖北钉螺线粒体CO I基因遗传变异研究

从长江中、下游的江苏省丹徒区和邗江区、浙江省平湖市、湖北省武昌区、江西省余干县和彭泽县、安徽省安庆市和贵池区等5个血吸虫病流行省8个点现场采集湖北钉螺样本,提取基因组DNA、PCR特异性扩增线粒体DNA细胞色素c氧化酶亚单位1（COI）基因,用ClustalX 1．81软件进行多序列比对,MEGA4．0软件中的Kimu...     

脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)3 个野生群体mtDNA 16S rRNA 序列差异及长臂虾科系统进化关系

采用PCR扩增和序列测定等技术,对脊尾白虾3个野生群体共计58个个体的线粒体16SrRNA基因片段进行初步研究。结果表明,在获得的长度为509bp核苷酸序列中,共检测到7个变异位点、8种单倍型,除象山湾群体外其它两个群体遗传多样性水平都较低。AMOVA分析表明,象山湾与莱州湾群体有显著的遗传差异,其余群体间的遗传差异不显著。另外,将本研究所得序列与GenBank中长臂虾科11个种的16SrRNA基因片段序列进行比较后,发现其聚类关系与传统分类略有不同,并依据16SrRNA序列变异百分比推测了长臂虾科12个种的大致分化时间。