黄姑鱼(Nibea albiflora)雌核发育的人工诱导及鉴定

采用紫外线(UV)灭活的同源精子通过冷休克抑制第二极体排放诱导黄姑鱼(Nibea albiflora)的雌核发育。结果表明,黄姑鱼精子最适的灭活剂量为420mJ/cm2,紫外照射剂量与黄姑鱼精子和卵子授精后的受精率及孵化率之间表现出明显的Hertwig效应。多次试验筛选的黄姑鱼雌核发育的最适条件为授精后2min于3℃处理8min。雌核发育仔鱼经形态学和流式细胞仪鉴定为二倍体。进一步利用10对微卫星分析了遗传物质在亲本和子代中的传递情况,结果表明雌核发育后代的等位基因完全来自于母本,没有父本基因参与;雌核发育后代在5个微卫星位点具有较高的重组率,使其与母本保持了高度同质性。     

黄姑鱼雌核发育的人工诱导及鉴定

采用紫外线（UV）灭活的同源精子通过冷休克抑制第二极体排放诱导黄姑鱼的雌核发育。黄姑鱼精子最适的灭活剂量为420 mJ/cm2,紫外照射剂量与黄姑鱼精子和卵子授精后的受精率及孵化率之间表现出明显的Hertwig效应。多次试验筛选的黄姑鱼雌核发育的最适条件为授精后2min在3℃处理8min。雌核发育仔鱼经形态学和流式细胞仪鉴定为二倍体。进一步利用10对微卫星分析了遗传物质在亲本和子代中的传递情况,结果表明雌核发育后代的等位基因完全来自于母本,没有父本基因参与;雌核发育后代在5个位点微卫星位点具有较高的重组率,使其与母本保持了高度同质性。     

大黄鱼雌核发育二倍体的人工诱导

采用紫外线照射对大黄鱼(Pseudosciaena crocea Richardson)精子遗传物质进行完全灭活,灭活后精子与卵子受精获得雌核发育单倍体受精卵,再通过冷休克对单倍体受精卵进行倍性恢复,成功诱导出大黄鱼雌核发育二倍体。实验结果表明:(1)在紫外照射过程中照射剂量与大黄鱼精子和卵子受精后其成活率和孵化率呈现出明显的Hertwig效应,紫外照射时间超过2 min(剂量>2 400 ergs/mm2),可使大黄鱼精子遗传物质完全灭活。大黄鱼雌核发育诱导中精子遗传灭活的最适紫外照射时间为2.5 min(剂量为3 000 ergs/mm2);(2)冷休克法可成功抑制大黄鱼受精卵第二极体排放,诱导效果受处理时刻、处理时间和处理温度三因素的影响。综合雌核发育二倍体的诱导率、处理后受精卵早期胚胎存活率和仔鱼孵化率等因素,较适合的染色体加倍条件为23℃培育水温下授精后2 min,在3-4℃海水中处理10 min。     

异源精子诱导牙鲆雌核发育二倍体

采用紫外线照射处理的石鲽精子和受精后冷休克的方法诱导了牙鲆雌核发育。结果表明:用2只平行的相距15cm的20W紫外灯管,照射距离为10cm,在5~100s时间范围内照射石鲽精子时,受精卵的发育表现了典型的哈特维希效应,照射40s的精子所得胚胎的孵化率达到最高峰(41%),染色体观察结果显示,此照射剂量组的所有胚胎均为单倍体(n=24),表明照射精子遗传失活的有效性和可靠性。如果冷休克处理前受精卵保持在(15.5±0.5)℃,受精卵在一定的休克温度(0~10℃)条件下,用不同休克起始时间(受精后1~10min)及冷休克处理持续时间(15~90min)均能诱导染色体加倍。对冷休克处理条件的优化结果表明,在2~4℃条件下,受精后3min开始、冷休克处理45min时,二倍体诱导率最高,达79.7%。染色体鉴定显示,处理组的正常胚胎均为二倍体(2n=48),未发现单倍体和非整倍体。     

条石鲷(Oplegnathus fasciatus)雌核发育的人工诱导与鉴定

条石鲷(Oplegnathus fasciatus)是我国重要的经济鱼类,具有复性染色体性别决定型(X₁X₁X₂X₂/X₁X₂Y)。利用紫外线(UV)灭活的同源精子通过冷休克方法诱导了条石鲷的雌核发育,筛选精子紫外灭活剂量并优化冷休克相关参数。结果表明:条石鲷精子最适的灭活剂量为80 mJ/cm2雌核发育的最适条件为授精后2 min在3～4°C水温下处理10 min。条石鲷雌核发育子代经形态学和流式细胞仪鉴定为二倍体,进一步利用微卫星分析表明雌核发育后代的等位基因完全来自于母本没有父本基因参与。对子代的性比和生长进行了比较,结果表明条石鲷雌核发育后代均为雌性,15月龄后雌核发育后代比普通条石鲷具有更快的生长速度。研究结果为条石鲷单性苗种的培育及其性别决定机制的深入研究提供基础。     

不同倍性大菱鲆胚胎发育的比较研究

对真鲷(Pagrosomus major)冷冻精液诱导的大菱鲆(Scophthalmus maximus)单倍体、雌核发育二倍体和杂交二倍体,以及同源精子诱导的大菱鲆三倍体和普通二倍体的胚胎发育时序和形态进行了比较研究。结果表明,在水温(14.5±0.5)℃、pH=7.8～8.2和盐度29.7的孵化条件下,整个胚胎发育阶段,三倍体和雌核发育二倍体胚胎发育速度一直较普通二倍体为慢,三倍体稍快于雌核发育二倍体;单倍体囊胚期前胚胎发育速度最快,囊胚期后发育速度逐渐变慢,至原肠期滞留时间最长;尾芽期前杂交二倍体的胚胎发育速度一直比普通二倍体快,至心跳期胚胎发育开始停止,胚胎死亡,不能正常孵出;除杂交二倍体外的各实验组至孵化出膜所需时间和孵化率分别为:普通二倍体109 h 15min和(83.4±3.02)%,三倍体109 h30 min和(44.6±2.40)%,雌核发育二倍体112 h 15 min和(42.4±3.54)%,单倍体124 h 40 min和(4.5±1.91)%。各组胚胎发育形态上的差别主要表现为杂交二倍体胚胎畸形,胚体细长,多数器官分化不全;单倍体表现出典型的单倍体综合症;雌核发育二倍体、三倍体胚胎与普通二倍体相比,形态上没有明显差别,但初孵仔鱼畸形率显著增高。     

同源和异源精子诱导大黄鱼(Pseudosciaena crocea)雌核发育的胚胎发育比较及子代 SSR 遗传标记分析

以紫外灭活的同源(大黄鱼)精子和未灭活的异源(鮸鱼)精子为激活源, 采用冷休克处理的方法诱导了大黄鱼雌核发育二倍体, 进行胚胎发育和 SSR 标记分析的比较研究。结果表明, 异源组的受精率和孵化率高于同源组, 但存活率低于同源组; 两组中经冷休克处理未能恢复倍性的胚胎发育畸形而陆续死亡, 恢复倍性的胚胎在发育程序上均与普通大黄鱼相同, 但各阶段出现时间较对照组滞后; SSR 分析显示同源组子代中有 16.7%出现父本条带, 异源组子代均未出现父本条带。以灭活的同源(大黄鱼)精子和未经灭活的     

低渗诱导栉孔扇贝三倍体及与其它方法的比较

采用低渗抑制受精卵第2极体(PB2)的释放诱导栉孔扇贝(Chlamys farreri)三倍体。水温20℃时,分别进行不同盐度处理(8~20)、不同起始处理时间(受精后15~40 min)和不同持续处理时间(10~25 min)的实验,对三倍体处理组和对照组幼虫的生长进行观察,同时将低渗、6-DMAP、热休克、冷休克4种诱导方法进行对比。结果表明:受精后30 min开始处理20 min,诱导率最高,可达(92.36±2.41)%,卵裂率为(49.78±6.51)%,孵化率为(61.82±1.63)%;D形幼虫期,处理组幼虫表现出明显的生长优势(P0.01),不仅生长速度快,而且发育到变态时个体比二倍体大;低渗诱导的三倍体率与6-DMAP相比无显著差异(P0.05);与热休克和冷休克相比差异显著(P0.01)。     

大菱鲆卵子排放后在卵巢腔内老化特征初探

为了探明大菱鲆(Scophthalmus maximus)卵子在卵巢腔内老化的原因及特征,采用连续跟踪采卵的方式,通过荧光染色、生理生化指标测定,对不同采卵时间(0, 3, 6, 9, 12 h)的卵子活性氧和脂质过氧化情况(氧化产物丙二醛MDA)、抗氧化系统(超氧化物歧化酶SOD,还原型谷胱甘肽GSH)、卵巢液pH值及受精率和孵化率进行对比研究。结果表明,随着卵子在体内老化时间的延长,其活性氧含量及脂质过氧化程度逐渐升高,活性氧含量及过氧化程度与排卵后卵子老化呈正相关;SOD酶活力,GSH酶活力均显著下降,MDA含量显著提高;受精率和孵化率均显著下降。排卵后6h,孵化率降到2.87%～10.60%,此时的卵质已经极度恶化,不能再继续用于后续的生产中。综上,在卵巢腔中,卵子排放后,随着时间的延长,活性氧含量显著升高,抗氧化能力逐渐下降,受精率和孵化率显著降低,老化逐渐加剧。     

长牡蛎和岩牡蛎种间配子兼容性及合子育性分析

为评估长牡蛎(Crassostrea gigas)和岩牡蛎(Crassostrea nippona)种间配子兼容性和合子育性水平,探讨两者的生殖隔离,采用完全双列杂交实验研究了温度(17、21、25、29和33℃)、盐度(18、22、26、30和34)和精子浓度(100、101、102、103和104个/μL)对受精率及孵化率的影响。结果表明,长牡蛎卵子可以与岩牡蛎精子受精,相反方向也能够受精,两者之间是双向受精;杂交组受精率及孵化率显著低于自繁组(P 0.05),且孵化率变化趋势与受精率基本一致。随着温度和盐度的上升,自繁组和杂交组受精率和孵化率呈先升后降的变化。长牡蛎♀(长牡蛎♂(GG)、长牡蛎♀(岩牡蛎♂(GN)、岩牡蛎♀(长牡蛎♂(NG)和岩牡蛎♀(岩牡蛎♂(NN)交配组胚胎发育最适温度分别为25、21、25和29℃,受精率和孵化率分别为87.0%、43.7%、42.8%、82.8%和76.9%、33.5%、33.4%、74.8%;GG和NG组最适盐度为26,GN和NN组最适盐度为30,各组在最适盐度下受精率和孵化率分别为86.6%、31.6%、41.2%、85.0%和77.3%、25.9%、37.7%、79.8%;在温度25℃、盐度26条件下,各组受精率随精子浓度增加而增大,尤其是杂交组,当精子浓度为100~104个/μL时,GN组受精率和孵化率分别为7.7%~43.9%和2.9%~39.9%;NG组受精率和孵化率分别是9%~46.2%和0%~44.2%。本研究证明温度、盐度和精子浓度对长牡蛎和岩牡蛎种间配子兼容性和合子育性有较大影响。     

人工诱导雌核发育牙鲆的染色体及核型证明

于1994-1996年,分别在威海海洋渔业捕捞公司（石岛）和鸿洋实业总公司龙须岛育苗场采集人工培育的3－5龄牙鲆亲鱼,采用紫外线照射法使牙鲆精子遗传物质失活,并用冷休克法抑制受精卵第二极体释放,从而获得雌核发育二倍体牙好。原肠期采用空气干燥法、Giemsa染色,得到雌核发育二倍体、正常二倍体及单倍体的染色体制片,进行染色体和核型的分析。结果表明,牙鲆的雌核发育二倍体和正常二倍体的染色体数均为2n=48,核型为48t,即48条端部着色点染色体,臂数NF=48,两者的核型设有明显差异;单倍体为24条端部着丝点染色体;在3个组别中,第一号染色体上都有一明显的次缢痕。雌核发育二倍体牙鲆的诱导率为98％。     

雌核发育牙鲆同工酶基因的重组及父方基因的表达

于1998年4、5月在山东省荣成市寻出水产公司养鱼场人工采集牙Ping成熟精卵，紫外线灭活精子遗传物质，冷休克诱导，获得雌核发育牙Ping。1999年5月收集57尾雌核发育牙Ping生化样品，采用淀粉胶电泳分析了LDH、IDHP、PGM、ACP、ADH、SDH、GDH、CAT等8种在野生种群中为多态的同工酶。结果表明，牙Ping雌核发育群体的Ldh-C、Cat两个基因座位发生了重组，基因座位与着丝点之间的重组率分别为52．6％和29．8％；Idhp－1有父方基因表达现象，说明雌核发育过程中父方基因可能在分子水平整合。牙Ping雌核发育群体的多态座位比例和平均杂合度分别为7．0％和0．035，远低于野生种群；研究表明，通过抑制第二极体排出获得的牙Ping雌核发子代尚有一定基因杂合，不能用于培育纯系。     

平鲷不同发育类型的染色体核型分析

研究了平鲷（Rhabdosargus sarba）自然群体和人工诱导雌核发育的染色体核型,结果表明：平鲷自然群体和雌核发育二倍体的染色体没有明显的形态结构差异,数目均为2n=48,中部着丝点染色体2对,亚中部着丝点染色体1对,亚端部着丝点染色体2对,端部着丝点染色体19对,其核型公式为4m＋2sm＋4st＋38t,染色体总臂数（NF）54,染色体上未见随体、次缢痕,也未发现有明显异形的性染色体;雌核发育单倍体染色体数目n=24,中部着丝点染色体有2条,亚中部着丝点染色体1条,亚端部着丝点染色体2条,端部着丝点染色体19条,核型公式为2m＋1sm＋2st＋19t,染色体总臂数（NF）27,单倍体染色体数量是其二倍体染色体的一半,其形态和结构与同源的另一套染色体相似.根据鲷科几种主要鱼类的核型,结合它们之间的杂交后代的性状表现和遗传亲和力、个体发育及其基本生物学特征分析,在分类学上平鲷可以归入鲷属,与黑鲷（Sparus macrocephalus）和黄鳍鲷（Sparus latus）同为一属.     

静水压力诱导牙鲆( Paralichthys olivaceus)四倍体的条件优化

采用静水压力抑制受精卵第一次卵裂的方法,进行了诱导牙鲆四倍体的研究。结果表明,将受精卵保持在(15.5±0.5)℃,从受精后70min开始用55MPa的压力处理6min后,正常仔鱼孵化率最高达到15.6%,此时的四倍体诱导率也最高达到63.3%。利用获得的最佳诱导条件处理获得了数千尾体长8—15cm的幼鱼,流式细胞仪检测和红血球长径测量结果显示,处理组幼鱼中四倍体约占13.3%,说明四倍体培育成功。该成果为开展牙鲆多倍体育种奠定了基础。     

栉江珧第1卵裂抑制型雌核发育二倍体人工诱导的研究

利用6-二甲基氨基嘌呤(60 mg/L;6-DMAP)抑制第一卵裂,成功诱导出栉江珧(Atrina pectinata)雌核发育二倍体.研究结果表明在培养温度为24℃的条件下,受精后60 min用质量浓度为60 mg/L的6-DMAP处理栉江珧受精卵15 min进行雌核发育二倍体的诱导效果理想,D形幼虫发生率和诱导率分别为14.7%和22.7%.细胞学观察显示,6-DMAP阻止了纺锤体的形成和染色体的移动,导致一个融合的二倍性雌性原核的形成.本研究结果首次提供了栉江珧雌核发育二倍体的细胞学证据.     

电刺激诱导栉孔扇贝雌核发育的相关参数的筛选

电刺激可诱导卵子雌核发育,但在海洋生物中尚无报道。为获得电刺激诱导栉孔扇贝雌核发育的最佳条件,采用正交设计的方法,分别研究了电场强度、电容、脉冲次数、卵子密度及缓冲液种类对诱导效果的影响。结果表明:(1)不同缓冲液的诱导效果差异不显著(P>0.05),但甘露醇缓冲液的诱导效果优于Zimmerman氏缓冲液和山梨醇缓冲液;最佳卵子密度为11.25×104个/mL,场强的最适范围为1.00～1.75kV/cm。最优电刺激诱导条件组合是:0.30mol/L甘露醇缓冲液,卵子密度11.25×104个/mL,脉冲强度1.20kV/cm,电容3μF,2次电脉冲。(2)应用优化后的电刺激参数诱导雌核发育,获得了最佳的诱导效果,得到的卵裂率为28.16%,胚胎存活率为98.37%。本研究首次成功应用电刺激法诱导了栉孔扇贝的雌核发育,并得到了单倍体胚胎,初步建立了栉孔扇贝中该诱导法的参数体系。     

栉孔扇贝第1卵裂抑制型雌核发育二倍体的研究

利用6-二甲基氨基嘌呤(60μg/cm3;6-DMAP)和细胞松弛素B(0.5μg/cm3;CB)抑制受精卵的第1次卵裂,授精后60和65 min分别用CB和6-DMAP持续处理20和15 min,可诱导出12.5%和27.5%的第1卵裂抑制型雌核发育二倍体.细胞学观察显示,6-DMAP抑制第1次卵裂产生的雌核发育二倍体主要在第1次有丝分裂后期的受精卵,由于破坏了纺锤体和阻止了染色体分离,导致一个二倍性雌核的形成,而CB有效地阻止了第1次卵裂的胞质分裂.尽管倍化率和D型幼虫发生率较低,但该研究首次报道了栉孔扇贝第1卵裂抑制型雌核发育二倍体诱导的可行性.     

犬齿牙鲆胚胎及仔、稚、幼鱼形态发育观察

犬齿牙鲆(Paralichthys dentatus)卵为端黄卵,受精卵浮性,卵径950~1100μm,油球径200~225μm.在水温20.5~22.0℃,盐度33条件下培育,受精后1 h 20 min 进入卵裂期,6 h 10 min 进入囊胚期,11 h 20 min 进入原肠胚期,19 h 10 min 发育到胚孔封闭期,胚体形成,26 h 50 min 尾芽出现,33 h 35 min心跳开始,48 h 10 min 开始孵化出仔鱼.初孵仔鱼平均全长2.59 mm±0.02 mm,在培育水温为17.0~21.0℃,盐度24~34条件下,胚后发育时序为:1日龄~9日龄为仔鱼前期,10日龄平均全长5.52 mm±0.05 mm,卵黄囊和油球完全吸收进入仔鱼后期;40日龄平均全长20.82 mm±0.67 mm,各鳍鳍条发育形成进入稚鱼期;65日龄平均全长41.13 mm±0.88 mm,全身鳞被完整进入幼鱼早期     

温度骤降对大黄鱼Larimichthys crocea鱼卵与仔鱼的影响

滨海电厂温排水停止排放以及季节更替、寒潮来袭等现象会引起海水温度降低,从而对鱼类等变温生物产生冷冲击效应。本研究通过模拟水温骤降情形,以孵化率、死亡率、畸形率等为指标,探讨了温度骤降对大黄鱼早期发育阶段(鱼卵和仔鱼)的冷冲击作用。研究发现,大黄鱼仔鱼(3日龄)对温度骤降的敏感性略高于鱼卵。在大黄鱼鱼卵和仔鱼的适温范围内,当水温由22 ℃骤降至19 ℃或16 ℃时,鱼卵的孵化率和死亡率无明显变化,而胚胎发育和仔鱼的生长发育均减缓,仔鱼的死亡率提高;水温超出适温范围,由22 ℃骤降至13 ℃或10 ℃时,对鱼卵和仔鱼造成致命的冷冲击伤害,48 h累积死亡率分别为84.6%~100%和72.1%~98.2%。由此推测:当水温骤降超出适温范围后,大黄鱼的早期发育阶段遭受致命的冷冲击伤害,从而影响种群补充和年龄结构。